實(shí)驗(yàn) 一RNA提取及檢測

實(shí)驗(yàn)一RNA提取及檢測第1頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩参颮NARNA提取及檢測方法二、實(shí)驗(yàn)試劑及材料水稻葉片、液氮、Trizol試劑、氯仿、異丙醇、DEPC水三、實(shí)驗(yàn)器材恒溫水浴鍋、PCR儀、臺式低溫離心機(jī)、移液槍、研缽、紫外分光光度計(jì)，一次性手套。第2頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實(shí)驗(yàn)步驟

采用Trizol法提取RNA(50－100mg組織∕mltrizol)，以加1mlTrizol為例，操作流程如下：(1)

研缽加液氮數(shù)次至足夠冷，加入樣品，研磨至粉末。加入Trizol（每100mg組織加1ml的Trizol），充分研磨，放在室溫下解凍。(2)

除不溶性物質(zhì)：2～8oC下12000g離心10min，不溶性物質(zhì)沉淀，將RNA的上清移入1.5ml離心管中。(3)相分離：在15～30℃下放置5min，使核蛋白復(fù)合物完全解離。加0.2ml氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫下溫浴2～3min。2～8℃下，≤12000g離心15min，RNA全部溶解于上層水相中，把水相移入另一1.5ml離心管中。

第3頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月(4)

氯仿再次去雜：加0.5ml氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫下溫浴2～3min；2～8℃下，≤12000g離心15min，把水相轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中。(5)

RNA沉積：加入0.5ml異丙醇，15～30℃溫浴10min；2-8℃下，≤12000g離心10min，RNA沉積在離心管的底部及側(cè)壁。(6)清洗RNA：加入1ml75%乙醇，2～8℃下≤7500g離心5min，小心將上清液倒掉。(7)再清洗：加入1ml75%乙醇，2～8℃下，≤7500g離心5min，小心將上清液倒掉。(8)RNA的溶解：將離心管倒扣在吸水紙上5～10min，每管加30μl的DEPC水，可在55～60℃下助溶10min。第4頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月(9)RNA濃度：用DEPC水稀釋100倍，用紫外分光光度計(jì)測定OD值（260nm、280nm230nm），估算RNA濃度。-70℃保存?？俁NA定量方法

RNA在260nm波長處有最大吸收峰。OD值為1相當(dāng)于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑，用ddH2O稀釋DNA樣品n倍并以ddH2O為空白對照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度：

RNA（mg/ml）=40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)(n)/1000

第5頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA濃度檢測過程（1）取少量待測RNA樣品，用DEPC水稀釋100倍。（2）用DEPC水做空白，在260nm、280nm、230nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)至零。（3）加入待測RNA樣品在三個(gè)波長處讀取OD值。

RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0，故根據(jù)OD260/OD280的比值可以估計(jì)RNA的純度。若比值較低，說明有殘余蛋白質(zhì)存在；比值太高，則提示RNA有降解。OD260/OD230比值應(yīng)≥2.0，若比值較低說明鹽分過高。第6頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳檢測RNA質(zhì)量：（1）配制1.2%的瓊脂糖凝膠（20mL）稱取瓊脂糖0.24g，加DEPC處理的ddH2O12.04mL，5×RNA電泳緩沖液4mL，電爐加熱融化瓊脂糖，冷卻至55°C，加入甲醛1.96mL，冷卻后倒膠。（2）RNA電泳取去離子甲酰胺10μL，甲醛1.5μL，10×RNABuffer2μL，RNA(2～4μg,<10μL)混合液，65°C加熱15min，迅速在冰浴中冷卻片刻，然后加入3μLRNA加樣緩沖液和0.5μLEB，上樣電泳。電泳Buffer為1×RNAbuffer。第7頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）RNA電泳結(jié)果判別質(zhì)量：出現(xiàn)的電泳條帶有兩條，是兩條最大的核糖體RNA（rRNA）分子，即18S和28SrRNA，較小的RNA也很豐富但看不到，因?yàn)樘?，跑出了凝膠的邊界。多數(shù)細(xì)胞中的信使RNA（mRNA）經(jīng)EB染色后不足以形成可見的帶。只要18S和28SrRNA帶亮，且28SrRNA大約為18SrRNA的兩倍，說明提取的RNA沒有發(fā)生降解，純度好。第8頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月五、總RNA提取常見問題分析RNA降解1、外源RNA酶的污染：試劑，器械及實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的RNA酶進(jìn)入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。2、內(nèi)源RNA酶的污染：抑制劑失效或者用量不夠，實(shí)驗(yàn)樣品過多；勻漿時(shí)溫度過高。3、外源性污染也可以排除，那么降解幾乎都來自裂解液的用量不足。如果將裂解液直接加入培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞，一定要使裂解液能覆蓋住細(xì)胞。在液氮條件下將組織研碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液。樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后移至-70℃冰箱保存。樣品決不能未經(jīng)液氮速凍而直接保存于-70℃冰箱中。樣品在與裂解液充分接觸前決不能出現(xiàn)融化，所以研磨用具必須預(yù)冷。第9頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月OD260/OD280比值偏低

1.蛋白質(zhì)污染：確保不要吸入中間層及有機(jī)相。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，則用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。

2.苯酚殘留：確保不要吸入中間層及有機(jī)相。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。

3.多糖或多酚的殘留：一些特殊的組織和植物中，多糖、多酚含量較多，這些殘留也會導(dǎo)致OD260/OD280比值偏低。因此，從這類材料中提取RNA時(shí)，需要注意多糖、多酚雜質(zhì)的去除。

4.設(shè)備限制：測定OD260及OD280數(shù)值時(shí)，要使OD260讀數(shù)在0.1-0.5之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測OD值時(shí)，對照及樣品稀釋液請使用10mMTris，pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值偏低。第10頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA提取得率低

1.該組織或者細(xì)胞中RNA含量偏低：不同細(xì)胞和組織中RNA的豐度不同，如肝臟，胰腺，心臟等是高豐度組織(總RNA含量2-4μg/mg)，腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢等是中豐度組織(總RNA含量0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低豐度組織(總RNA含量<0.05μg/mg)。

2.組織起始量太少或者太多：

樣品量過少，則細(xì)胞組織中RNA含量較低；樣品量過多則可能超過裂解液的裂解能力，裂解將不完全，從而導(dǎo)致RNA得率低。六、