蛋白質(zhì)(全套課件195P)-課件

第一篇

生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能2023/7/231生物大分子？特點(diǎn)：分子量較大（>104），結(jié)構(gòu)復(fù)雜定義：由一定的基本結(jié)構(gòu)單位按一定的順序和方式連接而成的多聚體種類：蛋白質(zhì)、核酸、聚糖、聚脂2023/7/232第一章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能StructureandFunctionofProtein2023/7/233什么是蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)(protein，Pr)是由氨基酸組成的、具有特定空間構(gòu)象和生物活性的生物大分子。2023/7/234蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)含量多：濕重：約占體重的17－22%；干重：約占細(xì)胞干重45%種類多：

一個大腸桿菌：＞3000種一個真核細(xì)胞：數(shù)千種

人體內(nèi)蛋白質(zhì)：＞10萬種

生物界：約1百億種分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細(xì)胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)2023/7/2351）作為生物催化劑:酶2）代謝調(diào)節(jié)作用:激素、生長因子3）免疫保護(hù)作用:免疫球蛋白4）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲:血紅蛋白、血漿脂蛋白5）運(yùn)動與支持作用:肌肉蛋白6）參與細(xì)胞間信息傳遞:G蛋白特殊生物學(xué)功能氧化供能參與構(gòu)成各種細(xì)胞及組織功能多：蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者2023/7/236蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能內(nèi)容蛋白質(zhì)的分子組成1蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系3蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)4蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析52023/7/237TheMolecularComponentofProtein第一節(jié)蛋白質(zhì)的分子組成2023/7/238一、蛋白質(zhì)的元素組成主要有C、H、O、N和S,其次有少量的P,Fe,Cu,Zn,Mn,I,…

。2023/7/239各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％

含氮量的測定:

凱氏定氮法蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)100gPr含氮16gPr克數(shù)=樣品中含氮克數(shù)×6.251g氮=6.25gPr2023/7/2310三聚氰胺(C3H6N6)2008年“三鹿奶粉事件”2023/7/2311二、氨基酸(aminoacids,

aa)

——組成蛋白質(zhì)的基本單位存在自然界中的氨基酸有300余種，但參與蛋白質(zhì)合成的氨基酸僅有20種，且均屬L-α-氨基酸（甘氨酸除外）。2023/7/23122023/7/2313H甘氨酸CH3丙氨酸L-α-氨基酸的通式Rα2023/7/23141.α碳原子上都有一個α-氨基和一個α-羧基∴它們都屬于α-氨基酸。2.除甘氨酸外,α碳原子均為手性碳原子∴每一種aa有兩種構(gòu)型：D-型和L-型。組成天然蛋白質(zhì)的20種aa，都屬L-型aa。參與蛋白質(zhì)合成的20種aa的共同特點(diǎn):2023/7/2315非極性脂肪族氨基酸(6種)極性中性氨基酸(6種)芳香族氨基酸(3種)酸性氨基酸(2種)堿性氨基酸(3種)三、氨基酸的分類（按側(cè)鏈理化性質(zhì)）2023/7/2316(一)非極性脂肪族氨基酸2023/7/2317(二)極性中性氨基酸2023/7/2318(三)芳香族氨基酸苯基吲哚基酚基2023/7/2319(四)酸性氨基酸2023/7/2320(五)堿性氨基酸咪唑基胍基2023/7/2321

20種氨基酸的名稱及縮寫代號2023/7/2322根據(jù)側(cè)鏈R基團(tuán)的結(jié)構(gòu)根據(jù)側(cè)鏈R基團(tuán)的酸堿性酸性aa堿性aa中性aa脂肪族aa芳香族aa雜環(huán)aa雜環(huán)亞aa其他分類方法2023/7/2323幾種特殊氨基酸脯氨酸唯一亞氨基酸2023/7/2324甘氨酸唯一非L-氨基酸H-CHCOO-

+NH32023/7/2325含硫氨基酸：含巰基的氨基酸：含羥基的氨基酸：支鏈氨基酸：蛋氨酸、半胱氨酸，蛋氨酸也叫甲硫氨酸。半胱氨酸絲氨酸、蘇氨酸纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸2023/7/23261.不存在Pr分子中，常以游離形式存在的氨基酸，如瓜氨酸，鳥氨酸，同型半胱氨酸、D-氨基酸等2.沒有遺傳密碼卻出現(xiàn)在Pr分子中的氨基酸，羥脯氨酸，羥賴氨酸，胱氨酸等非編碼氨基酸定義：參與Pr合成的20種氨基酸,又稱標(biāo)準(zhǔn)氨基酸

特點(diǎn)：有各自的遺傳密碼；無種屬特異性編碼氨基酸2023/7/2327+胱氨酸二硫鍵-HH2023/7/2328四、氨基酸的理化性質(zhì)1.兩性解離及等電點(diǎn)氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離方式取決于所處溶液的酸堿度。等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)

氨基酸分子所帶正、負(fù)電荷相等時，溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。2023/7/2329pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性離子陽離子陰離子2023/7/2330氨基酸等電點(diǎn)（PI）的計(jì)算中性氨基酸：pI=1/2（pK1+pK2)酸性氨基酸：pI=1/2（pK1+pK2)堿性氨基酸：pI=1/2（pK2+pK3)等于兼性離子兩邊pK值的平均值2023/7/2331+H++H+K1K2A0A+A-中性氨基酸pI計(jì)算pI=1/2（pK1+pK2）2023/7/2332+H++H++H+K1K2K3A+A0A-A2-2.093.869.82pI=(2.09+3.86)/2=2.97酸性氨基酸pI計(jì)算pI=1/2（pK1+pK2)2023/7/2333K1K2K3A2+A+A0A-+H++H++H+2.188.9510.53pI=(8.95+10.53)/2=9.74堿性氨基酸pI計(jì)算pI=1/2（pK2+pK3)2023/7/2334兩性解離及等電點(diǎn)應(yīng)用：1.電泳分離氨基酸2.離子交換樹脂分離氨基酸例：有一混合氨基酸溶液，各種氨基酸的pI為4.6；5.0；5.3；6.7；7.3。電泳時欲使其中4種泳向正極，緩沖液的pH應(yīng)該是：A．4.2B.

5.2C.

6.2D.

7.2E.

8.22023/7/23352.紫外吸收芳香族aa分子中有共軛雙鍵而對紫外光有吸收作用，最大吸收峰在280nm

附近，且光吸收強(qiáng)度與aa濃度成正比。芳香族氨基酸的紫外吸收苯丙氨酸應(yīng)用：Pr的定量測定2023/7/23363.茚三酮反應(yīng)

氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍(lán)紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。2023/7/2337應(yīng)用：法醫(yī)學(xué)上，用于采集犯罪現(xiàn)場留下來的指紋2023/7/2338五、肽(peptide)*肽鍵(peptidebond)是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的酰胺鍵。（一）肽與肽鍵2023/7/2339+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵2023/7/2340肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。兩分子氨基酸縮合形成二肽三分子氨基酸縮合則形成三肽……由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)

。由十個以上更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。2023/7/2341*多肽是鏈狀化合物，故又稱多肽鏈(polypeptidechain)

*多肽鏈中的氨基酸分子因?yàn)槊撍s合而基團(tuán)不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。2023/7/2342N端（氨基末端）：多肽鏈中有自由氨基的一端C端（羧基末端）：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈有兩端多肽鏈有方向性：N端C端2023/7/2343N端C端牛核糖核酸酶2023/7/2344書寫：可用略號，N端寫于左側(cè)，用H-或H2N-做標(biāo)記，C端于右側(cè)用-COOH或-OH表示。命名：簡單命名,甘異纈××××肽詳細(xì)命名為××?！痢刘！痢了?。肽鏈中氨基酸殘基順序的書寫及命名2023/7/2345蛋白質(zhì)和多肽兩詞沒有嚴(yán)格的界限，它們都是氨基酸的多聚物，許多場合常?；鞛橐徽?。通常把由39個aa殘基組成的促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）作為多肽，而把51個aa殘基的胰島素歸屬Pr，這就是習(xí)慣上的多肽與Pr的分界線。多肽和蛋白質(zhì)的關(guān)系2023/7/2346（二）幾種生物活性肽

1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)γαβ

γ-羧基2023/7/2347GSH過氧化物酶H2O22GSH

2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+GSH與GSSG（氧化型谷胱甘肽）間的轉(zhuǎn)換

2023/7/2348

GSH的功能抗氧化作用：GSH的巰基具有還原性，是細(xì)胞內(nèi)重要的還原劑，可保護(hù)結(jié)構(gòu)蛋白或功能蛋白中的-SH不被氧化，從而保護(hù)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性；還原細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，避免細(xì)胞受損解毒功能：-SH本身負(fù)電性強(qiáng)，親核性大。故可與親電子的毒物如致癌劑和藥物結(jié)合，從而避免這些毒物和DNA、RNA、Pr結(jié)合，保證DNA、RNA、Pr功能不受影響。2023/7/2349

體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽神經(jīng)肽：腦啡肽、內(nèi)啡肽2.多肽類激素及神經(jīng)肽2023/7/2350

小結(jié)蛋白質(zhì)的生物重要性蛋白質(zhì)的元素組成:C、H、O、N（16%）、S

凱氏定氮法測蛋白質(zhì)含量組成蛋白質(zhì)的基本單位是20種L-a氨基酸（甘氨酸除外）氨基酸的分類（5類）:結(jié)構(gòu)、三字符號氨基酸的性質(zhì)：兩性解離與等電點(diǎn)、紫外吸收（280nm）、茚三酮反應(yīng)肽及相關(guān)的概念氨基酸殘基生物活性肽：GSH2023/7/2351TheMolecularStructureofProtein

第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)2023/7/23522023/7/2353一級結(jié)構(gòu)(primarystructure)二級結(jié)構(gòu)(secondarystructure)三級結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)四級結(jié)構(gòu)(quaternarystructure)高級結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)2023/7/2354構(gòu)象（conformation):

即空間構(gòu)象或立體結(jié)構(gòu)，指分子中原子或基團(tuán)在三維空間的取向和定位，也就是三維結(jié)構(gòu)。構(gòu)象的改變不涉及共價鍵的改變，也沒有光學(xué)活性的改變。構(gòu)型（configuration)：

指原子在分子中呈光學(xué)不對稱排布的一種立體結(jié)構(gòu)。構(gòu)型有兩種，即D型和L型，只有分子的共價鍵斷裂，才能使一種構(gòu)型變成另一種構(gòu)型。

2023/7/2355肽鍵二硫鍵氫鍵鹽鍵疏水鍵范德華力主鍵包括共價鍵非共價鍵（次級鍵）蛋白質(zhì)分子中的化學(xué)鍵

副鍵（vandewaals）2023/7/2356d穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵d范德華力氫鍵疏水鍵范德華力離子鍵2023/7/2357穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵2023/7/2358定義:

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸從N-端至C-端的排列順序。一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是由遺傳信息來決定的氨基酸的排列順序?2023/7/2359研究一級結(jié)構(gòu)的意義：①氨基酸序列是蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的分子基礎(chǔ)；②一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，包含了形成特定空間結(jié)構(gòu)所需的全部信息，但不是決定Pr空間結(jié)構(gòu)的唯一因素；③眾多遺傳疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)是相關(guān)蛋白質(zhì)的氨基酸序列產(chǎn)生變異；④研究氨基酸序列可以闡明生命進(jìn)化史，氨基酸序列的相似性越大，物種之間的進(jìn)化關(guān)系越近。2023/7/23601965年我國科學(xué)家首先人工合成1954年Sanger闡明了其一級結(jié)構(gòu)胰島素2023/7/2361維持蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵:主要是肽鍵，另外還有二硫鍵胰島素2023/7/23622023/7/2363歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室EMBL

TheEuropean

Molecular

BiologyLaboratory)于1974年由歐洲14個國家加上亞洲的以色列共同發(fā)起建立，包括一個位于德國Heidelberg的核心實(shí)驗(yàn)室，及三個位于德國Hamburg，法國Grenoble及英國Hinxton的研究分部。由于具有開放和創(chuàng)新的良好學(xué)術(shù)氛圍，EMBL已發(fā)展成歐洲最重要和最核心的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究和教育培訓(xùn)機(jī)構(gòu)。

EMBL-DNA數(shù)據(jù)庫于1982年由EMBL建立，與美國的GenBank及日本的DDBJ共同組成全球性的國際DNA數(shù)據(jù)庫，近年來發(fā)展很快，在1995年數(shù)據(jù)量成倍遞增。EBI是EMBL在英國Hinxton的分部，主要負(fù)責(zé)建立EMBL－DNA數(shù)據(jù)庫，可進(jìn)行核苷酸序列檢索及序列相似性查詢。2023/7/23642023/7/2365GenBank簡介GenBank包含所有已知的核苷酸及蛋白質(zhì)序列、以及與之相關(guān)的生物學(xué)信息和參考文獻(xiàn)，是美國生物技術(shù)信息中心（NCBI）建立并維護(hù)的，是世界上的權(quán)威序列數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫序列的來源為作者直接遞交或間接查尋文獻(xiàn)所得，并與世界上其他公開發(fā)行的數(shù)據(jù)庫，如EMBL，DDBJ交換每日更新的數(shù)據(jù)。GenBank發(fā)展極為迅速，僅1995年一年里增加的序列數(shù)據(jù)量，即超過以往14年的累加數(shù)目。1995年的90.0版本含有492,483個不同的序列，總長度超過353,713,490個堿基。GenBank每條數(shù)據(jù)包含對序列的精確描述，序列來源生物的科學(xué)名稱及樹狀分類，以及特征數(shù)據(jù)欄，提供序列的蛋白編碼區(qū)和具有特殊生物學(xué)意義的位點(diǎn)，如轉(zhuǎn)錄單位(transcriptionunits)、突變或修飾位點(diǎn)(sitesofmutationsormodifications)及重復(fù)序列(repeats），還提供特定序列編碼的蛋白質(zhì)序列。2023/7/2366二、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象

。定義

特點(diǎn)：1.局部或某一段肽鏈2.主鏈構(gòu)象（-N-C-C-N-C-C-)3.不含側(cè)鏈（R）的構(gòu)象2023/7/2367*主鏈骨架：NCCNCCNCC…*側(cè)鏈：肽鏈中aa殘基中的R基團(tuán)2023/7/2368蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式

-螺旋(-helix)

-折疊(-pleatedsheet)

-轉(zhuǎn)角(-turn)

無規(guī)卷曲(randomcoil)

主要的化學(xué)鍵：氫鍵

2023/7/2369（一）肽單元肽鍵-CO-NH-中的四個原子和它相鄰的兩個α-碳原子位于同一平面，構(gòu)成了所謂的肽單元(peptideunit)

。2023/7/23701、肽單元中的N-C鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。2、肽鍵中的N-C鍵具有雙鍵性質(zhì)，就會有順反不同的立體異構(gòu)，已證實(shí)為反式構(gòu)型。3、C-C是單鍵，可自由旋轉(zhuǎn)，也正由于這兩個單鍵的自由旋轉(zhuǎn)角度，決定了相鄰肽單元之間的相對空間位置。肽單元的主要內(nèi)容2023/7/2371-螺旋：多肽鏈的主鏈原子沿一中心軸盤繞所形成的右手螺旋結(jié)構(gòu)。左手螺旋右手螺旋（二）-螺旋（-helix）2023/7/2372LPauling（鮑林）（1901－－1994）TheNobelPrizeinChemistry(1954)“forhisresearchintothenatureofthechemicalbondanditsapplicationtotheelucidationofthestructureofcomplexsubstances”TheNobelPeacePrize(1962)2023/7/2373特點(diǎn)：（1）右手螺旋（2）3.6殘基/螺旋螺距0.54nm

（3）維持鍵：氫鍵（4）R基在螺旋外側(cè)2023/7/2374-螺旋結(jié)構(gòu)2023/7/2375角蛋白Keratin廣泛存在于動物的毛發(fā)、甲、角、鱗和羽等，角蛋白中主要的是-角蛋白。-角蛋白主要由-螺旋構(gòu)象的多肽鏈組成。一般是由三條右手-螺旋肽鏈形成一個原纖維，原纖維的肽鏈之間有二硫鍵交聯(lián)以維持其穩(wěn)定性。2023/7/2376卷發(fā)的生化原理2023/7/2377（三）-折疊（-pleatedsheet）兩段或兩段以上折疊成鋸齒狀的多肽鏈通過氫鍵相連進(jìn)而形成較伸展的片層結(jié)構(gòu)。2023/7/23782023/7/2379⑴肽鍵平面折疊成鋸齒狀（折紙狀），R基交錯位于齒狀結(jié)構(gòu)上下方⑵氫鍵維持穩(wěn)定，與主鏈長軸垂直⑶兩條以上肽鏈并列時，-折疊有特點(diǎn)：順向反向平行2023/7/2380β-折疊：平行式和反平行式2023/7/2381-折疊結(jié)構(gòu)2023/7/2382絲蛋白是典型的反平行式折疊，多肽鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象。絲蛋白(fibroin)2023/7/2383α-螺旋和-折疊結(jié)構(gòu)比較區(qū)別點(diǎn)

α-螺旋-折疊形狀氫鍵R－基團(tuán)延伸性舉例2023/7/2384α-螺旋和-折疊結(jié)構(gòu)比較區(qū)別點(diǎn)

α-螺旋-折疊形狀螺旋狀鋸齒狀氫鍵鏈內(nèi)，與長軸平行鏈間，與長軸垂直R－基團(tuán)較大較小延伸性較大較小舉例毛發(fā)角蛋白蠶絲蛋白2023/7/2385（四）-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲-轉(zhuǎn)角：是多肽鏈180°回折部分所形成的一種二級結(jié)構(gòu)。無規(guī)卷曲：是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。2023/7/23862023/7/2387無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)

serineproteinaseinhibitorseaanemonetoxinEGF-likedomaininsulincomplementC-moduledomainsnaketoxin2023/7/2388

限制性內(nèi)切核酸酶BamHI的三級結(jié)構(gòu)-轉(zhuǎn)角-折疊無規(guī)卷曲-螺旋2023/7/2389（五）超二級結(jié)構(gòu)、模體和結(jié)構(gòu)域在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)組合，被稱為超二級結(jié)構(gòu)。1.超二級結(jié)構(gòu)2023/7/23902023/7/2391二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構(gòu)象，稱為模體(motif)

。模體是具有特殊功能的超二級結(jié)構(gòu)2.模體(motif)

2023/7/2392鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模體鋅指結(jié)構(gòu)模體常見的形式2023/7/2393Zincfinger是一種常出現(xiàn)在DNA結(jié)合蛋白中的一種結(jié)構(gòu)。由一個含有大約30個氨基酸的環(huán)和一個與環(huán)上的4個Cys或2個Cys和2個His配位的Zn2+構(gòu)成，形成的結(jié)構(gòu)像手指狀。2023/7/2394纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域

結(jié)構(gòu)域是位于超二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)間的一個層次，通常都是幾個超二級結(jié)構(gòu)單元的組合，各有獨(dú)特的空間構(gòu)象，并承擔(dān)不同的生物學(xué)功能。3.結(jié)構(gòu)域(domain)

2023/7/2395蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次2023/7/2396蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次

一級結(jié)構(gòu)（肽鏈結(jié)構(gòu)，指多肽鏈中的氨基酸排列順序）

↓

二級結(jié)構(gòu)（多肽鏈主鏈骨架盤繞折疊形成的有規(guī)律性的結(jié)構(gòu)）

↓

超二級結(jié)構(gòu)（模體）（相鄰二級結(jié)構(gòu)的聚集體）

↓

結(jié)構(gòu)域（在空間上可明顯區(qū)分的相對獨(dú)立的區(qū)域性結(jié)構(gòu)）

↓

三級結(jié)構(gòu)（蛋白質(zhì)中所有原子在空間的相對位置）

↓

四級結(jié)構(gòu)（亞基聚合體）

2023/7/2397（六）氨基酸殘基的側(cè)鏈對二級結(jié)構(gòu)形成的影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是以一級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側(cè)鏈適合形成-螺旋或β-折疊，它就會出現(xiàn)相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)。2023/7/23981）氨基酸側(cè)鏈所帶的電荷

——同性相斥，異性相吸；2）側(cè)鏈的大?。簜?cè)鏈大不易形成；3）側(cè)鏈的形狀：脯氨酸不能形成1、影響α-螺旋形成的因素：2、影響β-折疊形成的因素：要求側(cè)鏈較小2023/7/2399三、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。（一）定義

2023/7/23100N端C端肌紅蛋白（myoglobin,Mb）2023/7/23101肌紅蛋白（myoglobin,Mb）存在部位：心肌、骨骼肌功能：貯存氧組成：

153aa的單肽鏈＋血紅素結(jié)構(gòu)：球狀蛋白2023/7/23102

疏水鍵：數(shù)量最多 鹽鍵氫鍵 范德華力此外，某些Pr還有二硫鍵參與穩(wěn)定三級結(jié)構(gòu)維持三級結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵主要靠非共價鍵2023/7/23103二硫鍵2023/7/23104（二）分子伴侶分子伴侶(chaperon)是一類能介導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)行正確折疊的蛋白質(zhì)。*可逆地與未折疊肽段的疏水部分結(jié)合，防止錯誤折疊。*與錯誤聚集的肽段結(jié)合，誘導(dǎo)其正確折疊。*對蛋白質(zhì)分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起重要的作用。2023/7/23105伴侶蛋白在蛋白質(zhì)折疊中的作用2023/7/23106四、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的亞基(subunit)。亞基之間的結(jié)合力主要是氫鍵和離子鍵2023/7/23107由多個亞基組成的蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)中，若亞基分子結(jié)構(gòu)相同，稱之為同聚體，若亞基分子結(jié)構(gòu)不同，則稱之為異聚體。2023/7/23108含有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，單獨(dú)的亞基一般沒有生物學(xué)功能，只有完整的四級結(jié)構(gòu)才有生物學(xué)功能。

由一條肽鏈形成的Pr只有一、二和三級結(jié)構(gòu)，由兩條或兩條以上多肽鏈形成的Pr才可能有四級結(jié)構(gòu)。2023/7/23109血紅蛋白的一、二、三、四級結(jié)構(gòu)2023/7/23110血紅蛋白的一、二、三、四級結(jié)構(gòu)2023/7/23111蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)要點(diǎn)定義化學(xué)鍵類型一級二級三級四級2023/7/23112蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)要點(diǎn)定義化學(xué)鍵類型一級肽鍵二級氫鍵

-螺旋

-折疊

-轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲三級次級鍵四級次級鍵2023/7/23113五、蛋白質(zhì)的分類

*根據(jù)蛋白質(zhì)組成成分

單純蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)=蛋白質(zhì)部分+非蛋白質(zhì)部分*根據(jù)蛋白質(zhì)形狀

纖維狀蛋白質(zhì)：難溶于水，如膠原蛋白球狀蛋白質(zhì)：溶于水，如酶、免疫球蛋白輔基2023/7/23114分類輔基舉例脂蛋白脂類血漿脂蛋白（VLDL、LDL、HDL等）糖蛋白糖基或糖鏈膠原蛋白、纖連蛋白等核蛋白核酸核糖體磷蛋白磷酸基團(tuán)酪蛋白（casein）血紅素蛋白血紅素（鐵卟啉）血紅蛋白、細(xì)胞色素c黃素蛋白黃素核苷酸（FAD、FMN）琥珀酸脫氫酶金屬蛋白鐵鐵蛋白鋅乙醇脫氫酶鈣鈣調(diào)蛋白錳丙酮酸羧化酶銅細(xì)胞色素氧化酶結(jié)合蛋白質(zhì)及其輔基

2023/7/231152023/7/23116TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系2023/7/23117（一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)

一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是高級結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)

舉例：牛核糖核酸酶的變性復(fù)性實(shí)驗(yàn)二硫鍵2023/7/23118蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系要明白三點(diǎn)：

1.一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象和功能的基礎(chǔ)，空間構(gòu)象遭破壞的多肽鏈只要其肽鍵未斷，一級結(jié)構(gòu)未被破壞，就能恢復(fù)到原來的三級結(jié)構(gòu)，功能依然存在。

2.即使是不同物種之間的多肽和蛋白質(zhì)，只要其一級結(jié)構(gòu)相似，其空間構(gòu)象及功能也越相似。

3.物種越接近，其同類蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)越相似，功能也相似。但一級結(jié)構(gòu)中有些氨基酸的作用卻是非常重要的，若蛋白質(zhì)分子中起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基缺失或被替代，都會嚴(yán)重影響其空間構(gòu)象或生理功能，產(chǎn)生某種疾病，這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。

2023/7/23119

天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性2023/7/23120一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，但不是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的唯一因素。分子伴侶2023/7/231211）破壞非共價鍵（特別是氫鍵）的試劑：尿素，鹽酸胍。2）破壞（還原）二硫鍵的試劑：β-巰基乙醇，巰基乙酸、過甲酸、二硫蘇糖醇，二硫赤蘚糖醇。破壞蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的試劑2023/7/23122（一)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系2.一級結(jié)構(gòu)相似，其功能也相似（二）一級結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)

一級結(jié)構(gòu)不同，生物學(xué)功能各異如：血紅蛋白與胰島素3.一級結(jié)構(gòu)中非“關(guān)鍵”部分改變，功能不變?nèi)纾阂葝u素如：鐮刀形貧血4.一級結(jié)構(gòu)中“關(guān)鍵”部分改變，生物活性也改變，引起疾病如：細(xì)胞色素C2023/7/23123

同源性比較2023/7/23124胰島素氨基酸殘基差異部分A5A6A10B30人ThrSerIleThr豬ThrSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrGlyIleSer牛AlaGlyValAla羊AlaSerValAla馬ThrSerIleAla2023/7/23125

由同一基因進(jìn)化而來，具有相似結(jié)構(gòu)相似功能的一類蛋白質(zhì)，稱為同源蛋白質(zhì)。2023/7/23126組成：一條肽鏈（含104個氨基酸殘基）+鐵卟啉作用：傳遞電子，即Fe3++eFe2+目前已測定了近百種生物的細(xì)胞色素C的氨基酸順序，發(fā)現(xiàn)由于種屬遺傳差異，其一級結(jié)構(gòu)有較大的不同。

但有35個不變aa殘基，對維持細(xì)胞色素C的分子構(gòu)象和傳遞電子的功能是必需的。

細(xì)胞色素C2023/7/23127研究氨基酸序列可以闡明生命進(jìn)化史，氨基酸序列的相似性越大，物種之間的進(jìn)化關(guān)系越近。幾種生物和人的細(xì)胞色素C的氨基酸組成的差異38向日葵27果蠅12馬1獼猴0黑猩猩與組成人的細(xì)胞色素C的氨基酸的差別生物名稱2023/7/23128鐮刀形貧血（Sickle-cellofanemia）正常細(xì)胞鐮刀形細(xì)胞鐮刀狀貧血—血液中大量出現(xiàn)鐮刀紅細(xì)胞，其攜帶氧的功能只有正常紅細(xì)胞的一半，患者常因此缺氧窒息。2023/7/23129鐮刀形貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。2023/7/23130由于纈氨酸上的非極性基團(tuán)與相鄰非極性基團(tuán)間在疏水力作用下相互靠攏，并引發(fā)所在鏈扭曲為束狀，整個蛋白質(zhì)由球狀變?yōu)殓牭缎?，與氧結(jié)合功能喪失，導(dǎo)致病人窒息甚至死亡。谷A（極性）纈A（非極性）2023/7/23131二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

舉例：核糖核酸酶變性復(fù)性實(shí)驗(yàn)1.

構(gòu)象在，功能在舉例：血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)2.構(gòu)象改變，功能變化舉例：瘋牛病2023/7/23132（一）肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)

肌紅蛋白（Mb－Myoglobin）血紅蛋白（Hb－Hemoglobin）共性儲氧和供氧均為球狀蛋白質(zhì)均含血紅素輔基2023/7/23133血紅素結(jié)構(gòu)Fe離子六個配位鍵：4個與吡咯環(huán)上的N相連；1個與F螺旋段His的咪唑基相連；1個與O2結(jié)合2023/7/23134血紅素輔基的結(jié)構(gòu)及其氧合部位2023/7/231351.肌紅蛋白(Mb)本質(zhì)：結(jié)合Pr：1條多肽鏈（153個aa殘基）分子量：16，700功能：在肌肉中結(jié)合氧和儲存氧結(jié)構(gòu)：呈緊密球形，水溶性好多肽鏈分為8個α-螺旋區(qū)：A－H2023/7/231362.血紅蛋白(Hb)組成：Hb(成年）4條多肽鏈4分子血紅素Hb亞基之間通過8對鹽鍵，使4個亞基緊密結(jié)合而形成親水的球狀蛋白。

2α:141×22β:146×22023/7/23137血紅蛋白亞基間鹽鍵示意圖2023/7/23138Hb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合，Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分?jǐn)?shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。（二）血紅蛋白的構(gòu)象變化與結(jié)合氧

2023/7/23139肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線Mb:直角雙曲線Hb:“S”形曲線2023/7/23140*協(xié)同效應(yīng)(cooperativity)

蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此蛋白質(zhì)分子中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。

如果是促進(jìn)作用則稱為正協(xié)同效應(yīng)(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)

(negativecooperativity)2023/7/23141緊張態(tài)（tensestate）難與O2結(jié)合松弛態(tài)（relaxedstate）易與O2結(jié)合2023/7/23142O2血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑變小，就能進(jìn)入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。2023/7/231432023/7/23144變構(gòu)效應(yīng)(allostericeffect)在生物體內(nèi)，當(dāng)某種物質(zhì)特異地與蛋白質(zhì)分子的某個部位結(jié)合，觸發(fā)該蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生一定變化，從而導(dǎo)致其功能活性的變化，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變構(gòu)效應(yīng)，又稱別構(gòu)效應(yīng)。2023/7/23145（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病

蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病：若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時可導(dǎo)致疾病發(fā)生。2023/7/23146蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機(jī)理：有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨丁頓舞蹈病、瘋牛病等。2023/7/23147瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成為富含β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病瘋牛病(Madcowdisease)2023/7/23148正常PrP異常PrP2023/7/23149瘋牛病簡介1985年在英國發(fā)現(xiàn)，因其可致牛出現(xiàn)異常神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，富于攻擊性而取名“瘋牛病”；尸檢腦組織進(jìn)行病理檢查，發(fā)現(xiàn)類似于羊瘙癢病的海綿狀病變，命名：牛海綿狀腦?。╞ovinespongiformencephalopathy,BSE)瘋牛病屬于傳染性海綿狀腦病中的一種。2023/7/23150二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象是其功能活性的基礎(chǔ)舉例：核糖核酸酶變性復(fù)性實(shí)驗(yàn)1.

構(gòu)象在，功能在舉例：血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)2.構(gòu)象改變，功能變化舉例：瘋牛病3.構(gòu)象改變引起疾病2023/7/23151蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系小結(jié)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)舉例:牛核糖核酸酶的變性、復(fù)性實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)功能決定舉例:血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)2023/7/23152第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)ThePhysicalandChemicalCharactersofProtein2023/7/23153具有氨基酸性質(zhì)兩性電離紫外吸收性質(zhì)呈色反應(yīng)具有生物大分子特性

膠體性質(zhì)沉淀、變性和凝固等一、理化性質(zhì)

2023/7/23154（一）蛋白質(zhì)的兩性電離

蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。*蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。2023/7/23155pH=pIpH>pIpH<pI兼性離子

人體蛋白質(zhì)，pI~5.0在人體體液pH7.4的環(huán)境下，帶負(fù)電荷2023/7/23156（二）蛋白質(zhì)的紫外吸收由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。2023/7/23157（三）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)⒈茚三酮反應(yīng)(ninhydrinreaction)

蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。⒉雙縮脲反應(yīng)(biuretreaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，生成紫紅色的蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。2023/7/23158在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上，生成的蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸酚基與Folin-酚試劑(磷鉬酸和磷鎢酸化合物)反應(yīng)，生產(chǎn)藍(lán)色的化合物(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物)。3.Folin酚試劑法(Lowry’s法)2023/7/23159

反應(yīng)試劑顏色反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)的Pr及AA雙縮脲反應(yīng)

NaOH,稀CuSO4

紫或粉

2個以上肽鍵所有蛋白質(zhì)Millon反應(yīng)

Millon,硝酸，亞硝酸

紅色酚基Tyr黃色反應(yīng)

HNO3及NH3

黃、橘黃

苯基Phe,Tyr乙醛酸反應(yīng)乙醛酸H2SO4

紫紅吲哚Trp坂口反應(yīng)

次氯酸鈉,萘酚紅色

胍基ArgFolin酚試劑反應(yīng)

CuSO4磷鎢酸-鉬酸

蘭色

酚基Tyr茚三酮反應(yīng)

茚三酮

紫蘭色

游離氨、羧基Pro和羥Pro呈黃色（三）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)2023/7/23160（四）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)分子的直徑可達(dá)1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素:

水化膜顆粒表面電荷2023/7/23161+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉去水化膜，去電荷2023/7/231622023/7/23163（五）蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固

在某些物理和化學(xué)因素作用下，蛋白質(zhì)特定的空間構(gòu)象被破壞，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。*蛋白質(zhì)的變性(denaturation)概念2023/7/23164吳憲教授1931年：“天然蛋白質(zhì)分子借助次級鍵連接而成一種緊密、有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)，變性作用使次級鍵破壞從而使結(jié)構(gòu)松散”。“StudiesonDenaturationofProteins.XⅢ．ATheoryofDenaturation.ChinesejournalofPhysiology，1931，5(4)：321～344”。蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域內(nèi)國際上最具有權(quán)威的綜述性叢書《AdvancesinProteinChemistry》第47卷（1995年）發(fā)表了美國哈佛大學(xué)教授、蛋白質(zhì)研究的老前輩J.T.Eddsall的文章“吳憲與第一個蛋白質(zhì)變性理論（1931）HsienWuandthefirstTheoryofProteinDenaturation(1931)”，對吳憲教授的學(xué)術(shù)成就給予了極高的評價。該卷還重新刊登了吳憲教授六十四年前關(guān)于蛋白質(zhì)變性的論文。一篇在1931年發(fā)表的論文居然在1995年仍然值得在第一流的叢書上重新全文刊登，不能不說是國際科學(xué)界的一件極為罕見的大事。蛋白質(zhì)變性理論2023/7/23165造成變性的因素1）物理因素：高溫、高壓、射線、振蕩等2）化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽、生物堿試劑、尿素、有機(jī)溶劑等

變性的本質(zhì)——破壞蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)（非共價鍵和二硫鍵），不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（肽鍵、分子組成、分子量不變）。2023/7/23166變性后的表現(xiàn)：生物活性喪失理化性質(zhì)改變?nèi)芙舛冉档驼扯仍黾咏Y(jié)晶能力消失易被蛋白酶水解2023/7/23167②防止變性：低溫保存生物制品

應(yīng)用舉例

①利用變性：酒精消毒、高壓滅菌③取代變性：乳品解毒(用于急救重金屬中毒)2023/7/23168變性與復(fù)性(renaturation)

變性可逆變性：Pr變性后如將變性劑除去，該P(yáng)r分子的天然構(gòu)象和生物學(xué)活性還能恢復(fù)。不可逆變性：若變性條件強(qiáng)烈，作用時間長，構(gòu)象變化大，理化性質(zhì)難以恢復(fù)。復(fù)性2023/7/23169在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。凡是能消除蛋白質(zhì)表面的水化膜并中和電荷的試劑均可以引起蛋白質(zhì)的沉淀。常用的有中性鹽、有機(jī)溶劑、某些生物堿試劑、某些酸類及重金屬鹽類等。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。*蛋白質(zhì)沉淀2023/7/23170蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅(jiān)固的凝塊，此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中。

凝固是蛋白質(zhì)變性后進(jìn)一步發(fā)展的不可逆的結(jié)果。所以凝固的蛋白質(zhì)一定變性、沉淀。*蛋白質(zhì)的凝固作用(proteincoagulation)2023/7/23171*蛋白質(zhì)沉淀在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。*蛋白質(zhì)的凝固作用(proteincoagulation)

蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅(jiān)固的凝塊，此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中。

2023/7/23172變性物理因素：加熱、紫外線照射、超聲、劇烈震蕩等化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、重金屬鹽等沉淀改變pH至pI破壞水溶液中蛋白質(zhì)的水化膜和中和電荷（變性蛋白質(zhì)）（蛋白質(zhì)未變性）凝固加熱（變性，不再溶解）變性不一定沉淀沉淀不一定變性凝固則一定變性、沉淀加熱2023/7/23173第五節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析TheSeparationandPurificationandStructureAnalysisofProtein2023/7/23174分離純化蛋白質(zhì)的一般程序材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液抽提蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)粗制品的獲得進(jìn)一步分離純化獲得蛋白純品提取2023/7/23175*蛋白質(zhì)的分離和純化的依據(jù)溶解度分子大小電荷吸附性質(zhì)等———蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的差異2023/7/23176

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與常用的分離純化方法蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)常用的純化方法分子質(zhì)量透析、超濾凝膠層析離心溶解度調(diào)整pH調(diào)整離子強(qiáng)度降低介電常數(shù)電荷電泳等電聚焦離子交換層析特異結(jié)合性質(zhì)親和層析其他性質(zhì)吸附層析液相層析氣相層析2023/7/23177一、超速離心(ultracentrifugation)*利用機(jī)械的快速旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，將不同的物質(zhì)進(jìn)行分離*蛋白質(zhì)在離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient,S)表示。因?yàn)槌两迪禂?shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故應(yīng)用超速離心法既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。2023/7/231782023/7/23179鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法二、沉淀（precipitation）

2023/7/23180鹽析法定義：加入大量中性鹽以破壞Pr的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理:破壞Pr兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等優(yōu)點(diǎn)：Pr不變性，常用2023/7/23181試劑：丙酮、乙醇、甲醇等親水溶劑原理：與H2O結(jié)合，破壞水化層優(yōu)點(diǎn)：分辨率優(yōu)于鹽析法，能使某一Pr在狹小有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。缺點(diǎn)：易使Pr變性應(yīng)用：pI沉淀Pr。調(diào)節(jié)溶液pH到某Pr的pI，加上丙酮破壞水化膜，Pr沉淀。注意：防止Pr在分離過程中發(fā)生變性：①0－4℃下進(jìn)行；②有機(jī)溶劑濃度不能太高，Pr沉淀后立即分離有機(jī)溶劑沉淀法2023/7/23182*免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。免疫沉淀法：2023/7/23183三、透析及超濾法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。2023/7/23184人工腎血液透析圖2023/7/23185超濾（ultrafiltration）在一定的壓力下，使蛋白質(zhì)溶液在通過一定孔徑的超濾膜時，小分子量物質(zhì)濾過，而大分子量的蛋白質(zhì)被截留，從而達(dá)到分離純化的目的。磁力攪拌器待超濾的蛋白質(zhì)溶液加壓的氮?dú)獬瑸V膜2023/7/23186四、

電泳（electrophoresis）定義：帶電粒子在電場中向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。Pr分子在溶液中可帶凈的負(fù)電荷或帶凈的正電荷，故可在電場中發(fā)生移動。不同的蛋白質(zhì)分子所帶電荷量不同，且分子大小也不同，故在電場中的泳動速度也不同，由此可彼此分離。2023/7/23187幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS)常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。*等電聚焦電泳通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。

2023/7/23188SDS2023/7/231892023/7/23190等電聚焦（isoelectricfocusing,IEF）

+(H2SO4)

(NaOH)pH3pH10

+(H2SO4)

(NaOH)pI4.55.16.07.98.1pH3pH102023/7/23191等電聚膠電泳2023/7/23192雙向電泳（twodimensionalelectrophoresis）IEFSDS2023/7/23193雙向電泳（twodimensionalelectrophoresis）2023/7/231942023/7/23195五、層析層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。2023/7/23196組分A組分B固定相吸附結(jié)合等+流動相解除上述作用反復(fù)進(jìn)行組分A組分B移動速度不同層析的基本過程2023/7/23197蛋白質(zhì)分離常用的層析方法*離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。*凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。2023/7/23198離子交換層析2023/7/23199凝膠過濾大分子先洗脫下來小分子后洗脫下來2023/7/23200蛋白質(zhì)的分離純化：小結(jié)1、透析、超濾根據(jù)性質(zhì)：分子大小2、鹽析根據(jù)性質(zhì)：蛋白質(zhì)的沉淀作用機(jī)理：中性鹽中和表面電荷，破壞水化層影響因素：表面電荷、水化層、溶劑性質(zhì)2023/7/232013、電泳：根據(jù)性質(zhì)：蛋白質(zhì)的兩性解離作用機(jī)理：異性電荷互相吸引影響因素：電荷種類及數(shù)量、分子大小及形狀溶液離子強(qiáng)度及pH等4、層析（1）離子交換層析：電荷、分子量、分子形狀（2）親和層析：生物特性（3）吸附層析：吸附特性（4）凝膠過濾層析（分子篩）：分子大小及形狀大分子先洗脫下來5、超速離心：分子大小及形狀、溶液特性2023/7/23202六、多肽鏈中氨基酸序列分析分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。2023/7/23203COOHH2NCN

CN

CN

C

N分析殘基組成Edman降解法排列