現(xiàn)代生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)本科生課件

質(zhì)粒DNA的提取、擴(kuò)增和鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)質(zhì)粒的相關(guān)基本知識(shí)；掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理和方法。質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主的細(xì)胞質(zhì)中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對(duì)抗生素的抗性等。常見的天然質(zhì)粒有F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒和Col質(zhì)粒。

質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型:

緊密控制型(Stringentcontrol)

松馳控制型(Relaxedcontrol)

前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí)，它也不能復(fù)制，通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒,如F因子。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制，在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝，一般在20個(gè)以上，如Col質(zhì)粒。一個(gè)理想的質(zhì)粒克隆載體應(yīng)具有的特性:（1）分子量?。唬?）多拷貝、松馳控制型；（3）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單酶切位點(diǎn),即多克隆位點(diǎn)(MCS,multiplecloningsites)；（4）能插入較大的外源DNA片段；（5）具有容易操作的檢測(cè)表型。如抗生素抗性、a-互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，克隆載體如:pGEM-T、pUCm-T和pBluescript（簡(jiǎn)稱pBS）等，表達(dá)載體如:p1300質(zhì)粒等質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。常用的質(zhì)粒載體可以分為克隆載體和表達(dá)載體pBluescriptII儀器、試劑和材料

1、設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、PCR儀、高壓滅菌鍋、瓊脂糖凝膠電泳及分析系統(tǒng)等。2、試劑：Tris、EDTA、SDS、含質(zhì)粒大腸桿菌、瓊脂糖、溴化乙錠、DNAmarker等。超凈工作臺(tái)制冰機(jī)高速冷凍離心機(jī)水平電泳裝置

利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)質(zhì)粒DNA提取的實(shí)驗(yàn)原理利用染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。在堿變性條件下，細(xì)菌在NaOH和SDS溶液中裂解，蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生變性，但是染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋解開而變性，質(zhì)粒DNA氫鍵也大部分?jǐn)嗔?，雙螺旋也有部分解開，但共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)pH=4.8的乙酸鉀將其pH調(diào)到中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來(lái)的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性，形成纏繞的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)，在反應(yīng)體系中變性的蛋白質(zhì)會(huì)形成大量沉淀以及十二烷基磺酸鉀沉淀，染色體DNA會(huì)進(jìn)一步纏繞在這些沉淀上。離心后，染色體DNA與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去，質(zhì)粒DNA留在上清里。（1）取液體培養(yǎng)菌液10mL置離心管中，10000r/min離心10min去掉上清液。加入150μL的GET緩沖液，充分混勻，在室溫下放置10min。

（2）加入200μL新配置的0.2mol/LNaOH，1%SDS。加蓋，顛倒2~3次使之混勻。冰上放置5min。SDS能使細(xì)胞膜裂解，并使蛋白質(zhì)變性。質(zhì)粒DNA的提取步驟（3）加150μL冷卻的乙酸鉀溶液，加蓋后顛倒數(shù)次混勻，冰上放置15min。10000r/min離心5min，上清液倒入另一離心管中。乙酸鉀能沉淀SDS和SDS與蛋白質(zhì)的復(fù)合物。在冰上放置15min是為了使沉淀完全。（4）向上清液中加入等體積酚/氯仿，震蕩混勻，10000r/min離心2min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

（5）向上清液中加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置2min。離心5min，倒去上清乙醇溶液，將離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體，然后加入50μL的TE緩沖液保存。PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextensionPCR

productPCR反應(yīng)曲線標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ulPCR反應(yīng)五要素引物（primer）

酶（TaqDNApolymerase）

dNTP

（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)的原則（一）①引物長(zhǎng)度：

15-30bp，常用為20mer左右引物的有效長(zhǎng)度不能大于38mer，否則最適延伸溫度會(huì)超過(guò)TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性②引物擴(kuò)增跨度：以500bp為宜特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列引物設(shè)計(jì)的原則（二）④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶⑤引物3’端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì)

特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點(diǎn)被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處引物設(shè)計(jì)的原則（三）⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性⑧引物量：每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個(gè)典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)）濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少dNTP

的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系dNTP呈顆粒狀，保存不當(dāng)易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP

能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低模板（靶基因，targetgene）模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸模板（靶基因，targetgene）提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNAMg2+濃度Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的

PCR反應(yīng)中，各種NTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件:溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)溫度與時(shí)間的設(shè)置：設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100～300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸①變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗

②退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想引物的復(fù)性溫度

通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合③延伸溫度與時(shí)間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行③延伸溫度與時(shí)間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴(kuò)增10Kb需延伸至15min延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)：選在30～40次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多PCR反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高簡(jiǎn)便、快速對(duì)標(biāo)本的純度要求低1.按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑并混勻：

10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL

10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μL

質(zhì)粒DNA1.0μLTaq0.1μL(5U)

水補(bǔ)充至25.0μL操作步驟PCR技術(shù)的基本過(guò)程模板DNAdNTP

引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP

引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’

基本過(guò)程PCR技術(shù)的基本過(guò)程Taq酶模板DNAdNTP

引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP

引物Buffer72℃7min循環(huán)25次反應(yīng)完成后,將反應(yīng)液與凝膠電泳緩沖液按比例混勻,上樣電泳。操作步驟瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳法凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術(shù)。根據(jù)制備凝膠的材料:

瓊脂糖電泳凝膠電泳聚丙烯酰胺電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。二、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過(guò)程可以通過(guò)把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度。

注意事項(xiàng)：EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作要保持安靜、鎮(zhèn)定，注意樣品不能混樣，實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品

實(shí)驗(yàn)中提取的質(zhì)粒樣品。

電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測(cè)儀等。

瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），10X載樣緩沖液

實(shí)驗(yàn)步驟

⑴0.5g

瓊脂糖加入50ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖中加入0.5mlEB（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固。⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取4μl

樣品溶解液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。

⑸打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，電泳約40min-60min。（6）將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。質(zhì)粒DNA應(yīng)呈現(xiàn)二或三條不同構(gòu)型的條帶，這時(shí)表明所提樣品較純。溴酚藍(lán)前的熒光區(qū)是樣品中存有的RNA雜質(zhì)。若質(zhì)粒DNA樣品在遷移率小的地方還有熒光條帶，表明質(zhì)粒DNA樣品中有細(xì)菌的染色體DNA污染。（1）瓊脂糖含液體量大，可達(dá)98-99%，近似自由電泳，但是樣品的擴(kuò)散度比自由電泳小。（2）電泳速度快。（3）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測(cè)儀作定量測(cè)定。（4）樣品易回收，常用于制備。瓊脂糖電泳的優(yōu)點(diǎn)配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的DNA分子大小來(lái)確定。

瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍

開環(huán)(部分解鏈)閉環(huán)(螺旋)閉環(huán)(超螺旋)質(zhì)粒DNA1、學(xué)習(xí)酶的純化方法，酶蛋白分離提純的原理。2、學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞破壁、有機(jī)溶劑分級(jí)和離子交換柱層析技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)可以為大家提供一個(gè)較全面的實(shí)踐機(jī)會(huì)，學(xué)習(xí)如何提取純化、分析鑒定一種酶，并對(duì)這種酶的性質(zhì)，尤其是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)作初步的研究。酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究

實(shí)驗(yàn)原理酶是生物體內(nèi)具有催化功能的蛋白質(zhì)，可據(jù)酶蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)選擇分離提純條件和含量測(cè)定方法。酶分離提純的總目標(biāo)是提高純度（或比活力）及收率；依據(jù)在溶液中的性質(zhì)（分子大小、溶解度、電荷、吸附等）進(jìn)行分離;胞內(nèi)酶的分離提純步驟：選材、破壁、提取、分離、純化、測(cè)活、保存；用測(cè)定酶活力的方法跟蹤酶的去向、衡量酶提純的程度和得率。酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)（反應(yīng)速度及影響因素）:1）底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響2）酶濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響3）pH值對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響4）溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響5）激活劑、抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響.自1860年Bertholet從啤酒酵母（Sacchacomyces

Cerevisiae）中發(fā)現(xiàn)了蔗糖酶以來(lái)，它已被廣泛地進(jìn)行了研究。蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3.2.1.26）特異地催化非還原糖中的β-呋喃果糖糖苷鍵水解，具有相對(duì)專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。

實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)提取啤酒酵母中的蔗糖酶。該酶以兩種形式存在于酵母細(xì)胞膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞膜外細(xì)胞壁中的稱之為外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)中的稱之為內(nèi)蔗糖酶，含有少量的糖。兩種酶的蛋白質(zhì)部分均為雙亞基，二聚體，兩種形式的酶的氨基酸組成不同，外酶每個(gè)亞基比內(nèi)酶多兩個(gè)氨基酸，Ser和Met，它們的分子量也不同，外酶約為27萬(wàn)(或22萬(wàn)，與酵母的來(lái)源有關(guān))，內(nèi)酶約為13.5萬(wàn)。盡管這兩種酶在組成上有較大的差別，但其底物專一性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)仍十分相似，因此，本實(shí)驗(yàn)未區(qū)分內(nèi)酶與外酶，而且由于內(nèi)酶含量很少，極難提取，本實(shí)驗(yàn)提取純化的主要是外酶。名稱MW糖含量亞基為蔗糖的Km為棉子糖的KmpI

最適pH穩(wěn)定pH最適溫度外酶27萬(wàn)50%雙26mM150mM5.04.93.0-7.560℃內(nèi)酶13.5萬(wàn)＜3%雙25mM150mM5.04.56.0-9.060℃實(shí)驗(yàn)中，用測(cè)定生成還原糖（葡萄糖和果糖）的量來(lái)測(cè)定蔗糖水解的速度，在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘水解底物的量定為蔗糖酶的活力單位。比活力為每毫克蛋白質(zhì)的活力單位數(shù)。兩種酶的性質(zhì)對(duì)照表如下：一、蔗糖酶的提取與部分純化二、離子交換柱層析純化蔗糖酶三、蔗糖酶各級(jí)分活性及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)分三個(gè)方面實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞破壁的幾種方法1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動(dòng)開關(guān)后，逐步加速至所需速度。2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。3、反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。4、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料。5、化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。6、有機(jī)溶劑沉淀法：即向水溶液中加入一定量的親水性的有機(jī)溶劑可降低溶質(zhì)的溶解度使其沉淀被析出。（一）蔗糖酶的提取與部分純化（1）準(zhǔn)備一個(gè)冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。（2）稱取3g干啤酒酵母，稱20mg蝸牛酶及適量（約3g）二氧化硅，放入研缽中。二氧化硅要預(yù)先研細(xì)。（3）量取預(yù)冷的甲苯6ml+6ml緩慢加入酵母中，邊加邊研磨成糊狀，約需40分鐘。研磨時(shí)用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細(xì)胞大部分研碎。（4）緩慢加入預(yù)冷的20ml去離子水，每次加2ml左右，邊加邊研磨，至少用20分鐘。以便將蔗糖酶充分轉(zhuǎn)入水相。（5）將混合物轉(zhuǎn)入兩個(gè)離心管中，平衡后，用高速冷凍離心機(jī)離心，4℃，5000rpm，15min。如果中間白色的脂肪層厚，說(shuō)明研磨效果良好。用滴管吸出上層有機(jī)相。

（6）用滴管小心地取出脂肪層下面的水相，轉(zhuǎn)入另一個(gè)清潔的離心管中。操作步驟4℃，5000rpm，離心15min。（7）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，留出1.5ml測(cè)定酶活力及蛋白含量。剩余部分轉(zhuǎn)入清潔離心管中。（8）用廣泛pH試紙檢查清液pH，用1M乙酸將pH調(diào)至5.0，稱為“粗級(jí)分I”。2.熱處理

（1）預(yù)先將恒溫水浴調(diào)到50℃，將盛有粗級(jí)分I的離心管穩(wěn)妥地放入水浴中，50℃下保溫30分鐘，在保溫過(guò)程中不斷輕搖離心管。（2）取出離心管，于冰浴中迅速冷卻，用4℃，5000rpm，離心15min。（3）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，留出1.5ml測(cè)定酶活力及蛋白質(zhì)含量（稱為“熱級(jí)分II”）。3.乙醇沉淀

將熱級(jí)分II轉(zhuǎn)入小燒杯中，放入冰鹽?。](méi)有水的碎冰撒入少量食鹽），逐滴加入等體積預(yù)冷至-20℃的95%乙醇，同時(shí)輕輕攪拌，共需30分鐘，再在冰鹽浴中放置10分鐘，以沉淀完全。于4℃，5000rpm，離心15min，傾去上清，并風(fēng)干，沉淀保存于離心管中，蓋上蓋子，然后將其放入冰箱中冷凍保存（稱為“醇級(jí)分Ⅲ”）。離子交換層析

離子交換層析技術(shù)是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相，以蛋白質(zhì)等樣品為移動(dòng)相，分離和提純蛋白質(zhì)、核酸、酶、激素和多糖等的一項(xiàng)技術(shù)。

在纖維素與葡聚糖分子上結(jié)合有一定的離子基團(tuán)，當(dāng)結(jié)合陽(yáng)離子基團(tuán)時(shí)，可換出陰離子，則稱為陰離子交換劑。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纖維素。在纖維素上結(jié)合了DEAE，含有帶正電荷的陽(yáng)離子纖維素—O—C6H14NH+，它的反離子為陰離子（如Cl-等），可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)陰離子進(jìn)行交換。當(dāng)結(jié)合陰離子基團(tuán)時(shí)，可置換陽(yáng)離子，稱為陽(yáng)離子交換劑，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纖維素。纖維素分子上帶有負(fù)電荷的陰離子（纖維素－O－CH2－COO-），其反離子為陽(yáng)離子（如Na+等）,可與帶正電荷蛋白質(zhì)陽(yáng)離子進(jìn)行交換。溶液的pH值與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相同時(shí)，靜電荷為0，當(dāng)溶液pH值大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，則羧基游離，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。反之，溶液的pH值小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，則氨基電離，蛋白質(zhì)帶正電荷。溶液的pH值距蛋白質(zhì)等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)的電荷越多。反之則越少。

在適當(dāng)?shù)柠}濃度下，溶液的pH值高于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)被陰離子交換劑所吸附；當(dāng)溶液的pH值低于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)被陽(yáng)離子交換劑所吸附。由于各種蛋白質(zhì)所帶的電荷不同。它們與交換劑的結(jié)合程度也不同，只要溶液pH值發(fā)生改變，就會(huì)直接影響到蛋白質(zhì)與交換劑的吸附，從而可能把不同的蛋白質(zhì)逐個(gè)分離開來(lái)。交換劑對(duì)膠體離子（如蛋白質(zhì)）和無(wú)機(jī)鹽離子（如NaCl）都具有交換吸附的能力，當(dāng)兩者同時(shí)存在于一個(gè)層析過(guò)程中，則產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性的交換吸附。當(dāng)Cl-的濃度大時(shí)，蛋白質(zhì)不容易被吸附，吸附后也易于被洗脫，當(dāng)Cl-濃度小時(shí)，蛋白質(zhì)易被吸附，吸附后也不容易被洗脫。因此，在離子交換層析中，一般采用兩種方法達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。一種是增加洗脫液的離子強(qiáng)度，一種是改變洗脫液的pH值。pH值增高時(shí)，抑制蛋白質(zhì)陽(yáng)離子化，隨之對(duì)陽(yáng)離子交換劑的吸附力減弱。pH值降低時(shí)，抑制蛋白質(zhì)陰離子化，隨之降低了蛋白質(zhì)對(duì)陰離子交換劑的吸附。當(dāng)使用陰離子交換劑時(shí)，增加鹽離子，則降低pH值。當(dāng)使用陽(yáng)離子交換劑時(shí)，增加鹽離子濃度，則升高溶液pH值。離子交換劑使用前一般要進(jìn)行處理。干粉狀的離子交換劑首先要進(jìn)行膨化，將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的電荷基團(tuán)充分暴露出來(lái)。而后用水懸浮去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了進(jìn)一步去除雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。市售的離子交換劑中通常陽(yáng)離子交換劑為Na型（即平衡離子是Na離子），陰離子交換劑為Cl型，因?yàn)橥ǔ＿@樣比較穩(wěn)定。處理時(shí)一般陽(yáng)離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。常用的酸是HCl，堿是NaOH或再加一定的NaCl，這樣處理后陽(yáng)離子交換劑為Na型，陰離子交換劑為Cl型。使用的酸堿濃度一般小于0.5mol/L，浸泡時(shí)間一般30min。處理時(shí)應(yīng)注意酸堿濃度不宜過(guò)高、處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)、溫度不宜過(guò)高，以免離子交換劑被破壞。另外要注意的是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會(huì)影響分離效果。柱上操作⑴交換劑裝柱最簡(jiǎn)單的交換層析柱可用堿式滴定管代替。處理過(guò)的樹脂放入燒杯，加少量水邊攪拌邊倒入保持垂直的層析管中，使樹脂緩慢沉降。交換劑在柱內(nèi)必須分布均勻。

⑵上樣向?qū)游鲋鶅?nèi)傾入樣品液⑶洗脫與收集

不同樣品選用的洗脫液不同。原則是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子，把吸著物交換出來(lái)。由于被吸著的物質(zhì)往往不是我們所要求的單一物質(zhì)，因此除了正確選擇洗脫液外還采控制流速和分布收集的方法來(lái)獲得所需的單一物質(zhì)。離子交換柱層析純化蔗糖酶操作步驟1.離子交換劑的處理：稱取1.5克DEAE纖維素（DE-23）干粉，加入0.5MNaOH溶液（約50ml），輕輕攪拌，浸泡至少0.5小時(shí)（不超過(guò)1小時(shí)），用玻璃砂漏斗抽濾，并用去離子水洗至近中性，抽干后，放入小燒杯中，加50ml0.5MHCl,攪勻，浸泡0.5小時(shí)，同上，用去離子水洗至近中性，再用0.5MNaOH重復(fù)處理一次，用去離子水洗至近中性后，抽干備用。（因DEAE纖維素昂貴，用后務(wù)必回收）。實(shí)際操作時(shí)，通常纖維素是已浸泡過(guò)回收的，按“堿→鹽”的順序洗即可（0.5MNaOH,1MNaCl溶液處理），然后水洗至中性。最后保存在20%的酒精溶液中。2.裝柱與平衡：

先將層析柱垂直裝好，在燒杯內(nèi)用0.02mol/LpH7.3Tris-HCl緩沖液洗纖維素幾次，用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱，然后用此緩沖液洗柱至流出液的電導(dǎo)率與緩沖液相同或接近時(shí)即可上樣。（一般洗2-3個(gè)柱體積）3.上樣與洗脫：上樣前先準(zhǔn)備好梯度洗脫液，本實(shí)驗(yàn)采用30ml0.02MpH7.3的Tris-HCl緩沖液和30ml含0.2MNaCl的0.02mol/LpH7.3的Tris-HCl緩沖液，進(jìn)行線性梯度洗脫。取兩個(gè)相同直徑的50ml量杯，一個(gè)裝30ml含NaCl的高離子強(qiáng)度溶液，另一個(gè)裝入30ml低離子強(qiáng)度溶液，放在磁力攪拌器上，在低離子強(qiáng)度溶液的量杯內(nèi)放入一個(gè)小攪拌子，使兩杯溶液形成連通，注意兩個(gè)杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。

用5ml0.02MpH7.3的Tris-HCl緩沖液充分溶解醇級(jí)分Ⅲ，若溶液混濁，則用小試管，4000rpm離心除去不溶物。取1.5ml上清液（即醇級(jí)分Ⅲ樣品，留待下一個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)酶活力及蛋白含量），將剩余的3.5ml清液小心地加到層析柱上，不要擾動(dòng)柱床，注意要從上樣開始使用部分收集器收集，每管3.0ml/10min。上樣后用緩沖液洗兩次，然后再用約20ml緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質(zhì)，至A280降到0.1以下，夾住層析柱出口，將恒流泵入口的細(xì)塑料導(dǎo)管放入不含NaCl的低離子強(qiáng)度溶液的小燒杯中，接好層析柱，打開磁力攪拌器，放開層析柱出口，開始梯度洗脫，連續(xù)收集洗脫液，兩個(gè)小燒杯中的洗脫液用盡后，為洗脫充分，也可將所配制的剩余30ml高離子強(qiáng)度洗脫液倒入小燒杯繼續(xù)洗脫，控制流速3.0ml/10min。

測(cè)定每管洗脫液的A280光吸收值，合并活性最高的2-3管，量出總體積，此即“柱級(jí)分IV”。注意：從上樣開始收集，可能有兩個(gè)活性峰，梯度洗脫開始前的第一個(gè)峰是未吸附物，本實(shí)驗(yàn)取用梯度洗脫開始后洗下來(lái)的活性峰。各級(jí)分蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮蘭染料法（Bradford法）的微量法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，參見實(shí)驗(yàn)－“蛋白質(zhì)含量的測(cè)定法”。各級(jí)分先要仔細(xì)尋找和試測(cè)出合適的稀釋倍數(shù)，并詳細(xì)記錄稀釋倍數(shù)的計(jì)算（使用移液管和量筒稀釋）。下列稀釋倍數(shù)僅供參考：粗級(jí)分I：10～50倍熱級(jí)分II：10～50倍醇級(jí)分III：10～50倍柱級(jí)分IV：不稀釋12345待測(cè)樣品標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(ml)00.020.040.060.080.1雙蒸水ml0.10.080.060.040.020考馬斯亮藍(lán)ml555555A595蛋白質(zhì)含量的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度：1mg/ml蔗糖酶各級(jí)分活性的測(cè)定

測(cè)定蔗糖酶活性的方法有許多種，如費(fèi)林試劑法、Nelson’s試劑法、水楊酸試劑法等，本實(shí)驗(yàn)先使用費(fèi)林試劑法，以后測(cè)米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax時(shí)再用Nelson’s試劑法。費(fèi)林試劑法靈敏度較高，但數(shù)據(jù)波動(dòng)較大，因?yàn)榉磻?yīng)后溶液的顏色隨時(shí)間會(huì)有變化，因此加樣和測(cè)定光吸收值時(shí)最好能計(jì)時(shí)。其原理是在酸性條件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。這些具有還原性的糖與堿性銅試劑混合加熱后被氧化，二價(jià)銅被還原成棕紅色氧化亞銅沉淀，氧化亞銅與磷鉬酸作用，生成蘭色溶液，其蘭色深度與還原糖的量成正比，于650nm測(cè)定光吸收值。級(jí)分I、II、III蔗糖酶活性測(cè)定用去離子水代替稀釋各級(jí)分酶液，試測(cè)出測(cè)酶活合適的稀釋倍數(shù)：I：1000～10000倍

II：