生物化學(xué)動物細胞工程制藥課件

生物化學(xué)動物細胞工程制藥(ppt)（優(yōu)選）生物化學(xué)動物細胞工程制藥3.1動物細胞的形態(tài)和生理特性3.2生產(chǎn)用動物細胞的要求和獲得3.3動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基3.4動物細胞培養(yǎng)的基本方法3.5動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法和操作方式3.6動物細胞生物反應(yīng)器3.7動物細胞產(chǎn)品制造實例3.8動物細胞制藥的前景與展望3.1動物細胞的形態(tài)和生理特性一、動物細胞的形態(tài)

離體培養(yǎng)的動物細胞主要為哺乳動物細胞。根據(jù)是否需要帖附于支持物上生長的性質(zhì)，可將動物細胞分為貼壁依賴型和懸浮型兩類。1、貼壁依賴型絕大多數(shù)細胞在培養(yǎng)時必須貼附在某一固相表面才能生存和生長。按培養(yǎng)細胞的貼壁的形態(tài)主要分為4類。（1）成纖維細胞型形狀與體內(nèi)成纖維細胞形狀相似而得名，細胞大致呈梭形或不規(guī)則三角形。（2）上皮細胞型形狀為扁平的不規(guī)則多角型。（3）游走細胞型在支持物上分散生長，不連接成片，呈活躍的游走和變形運動。（4）多形性細胞形態(tài)不規(guī)則。

2、懸浮型

少數(shù)細胞在培養(yǎng)時呈懸浮生長，來源于血液、淋巴組織的細胞、某些腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉(zhuǎn)化細胞為懸浮型。形態(tài)常為球形，可懸浮培養(yǎng)。3、兼性貼壁細胞不嚴格的依賴支持物某些情況下可在培養(yǎng)基中良好懸浮生長。二、動物細胞的生理特征動物細胞培養(yǎng)的一些基本概念：

動物細胞體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)（繼代培養(yǎng)）。原代培養(yǎng)是指從機體取出組織或細胞進行初次培養(yǎng)的過程。傳代培養(yǎng)是指從原代培養(yǎng)的細胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便稱為細胞系。通過選擇或克隆形成法從原代培養(yǎng)細胞或細胞系中獲得的具有特異性質(zhì)或標記的細胞，稱為細胞株。不能繼續(xù)傳代或傳代次數(shù)有限的細胞系或細胞株稱為有限細胞系或細胞株?？蛇B續(xù)傳代的細胞系或細胞株稱為連續(xù)細胞系或細胞株。有限細胞系（株）可通過自發(fā)、病毒感染、癌基因轉(zhuǎn)移、與其他連續(xù)細胞融合等方法轉(zhuǎn)化得到連續(xù)細胞系（株）。動物細胞的生理特征:1.細胞分裂周期長（12~48h）

2.細胞生長需貼附基質(zhì)，存在接觸抑制3.正常二倍體細胞生長壽命有限二、動物細胞的生理特征4.對周圍環(huán)境十分敏感5.對培養(yǎng)基要求高

氨基酸、維生素、無機鹽、細胞生長因子、貼壁因子、血清等。6.對蛋白合成途徑和修飾與細菌不同（糖基化）目前，動物細胞和細菌生產(chǎn)的產(chǎn)品，產(chǎn)值約各占一半。3.2生產(chǎn)用動物細胞的要求和獲得一、生產(chǎn)用動物細胞的要求原代細胞－－－二倍體細胞－－－連續(xù)細胞腺病毒疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗事故（錯用癌細胞）皮下注射癌細胞實驗最終產(chǎn)品殘留DNA嚴格限制。

1986年，從淋巴瘤患者分離轉(zhuǎn)化細胞Namalwa細胞，生產(chǎn)干擾素用于臨床。猴腎轉(zhuǎn)化細胞Vero生產(chǎn)狂犬疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗被批準大量用于人群。1987年，雜交瘤細胞生產(chǎn)OKT3單抗用于臨床排異反應(yīng)。1988年后，大批異倍體傳代細胞生產(chǎn)的重組蛋白被批準上市。

最終產(chǎn)品殘留DNA嚴格限制。

二、生產(chǎn)用動物細胞的獲得1 .原代細胞直接取自動物組織、器官，經(jīng)粉碎、消化得到的細胞懸液。

需要大量動物。雞胚細胞、原代兔腎或鼠腎細胞、血液淋巴細胞。2.二倍體細胞系通過篩選、克隆從原代培養(yǎng)細胞中獲得的具有某種特征的有限細胞株有限增殖、2n、貼壁、接觸抑制

MRC-5、WI-38

MRC-5：1966年，14周正常男性胎肺組織中獲得2n=46

壽命42~46代用于人用疫苗的生產(chǎn)3、轉(zhuǎn)化細胞系

通過某個轉(zhuǎn)化過程形成，常由于染色體斷裂成為異倍體。自發(fā)形成，嚙齒動物細胞多發(fā)；病毒感染后轉(zhuǎn)化；直接從動物腫瘤組織中建立的細胞系。轉(zhuǎn)化細胞具有無限生命力，一般倍增時間短、對培養(yǎng)條件和生長因子要求較低。

CHO（中國倉鼠卵巢細胞）、COS、BHK-21、Namalwa、Vero細胞等。

COS細胞（非洲綠猴腎細胞）：1981年，Gluzman用復(fù)制起點缺失的SV40(猿猴空泡病毒40)轉(zhuǎn)化非洲綠猴腎細胞CV-1，獲得3個細胞系：COS-1、COS-3、COS-7。COS細胞組成性表達SV40大T抗原，帶有SV40ori復(fù)制子的質(zhì)粒以附加體的形式高拷貝擴增（105拷貝）大量擴增質(zhì)粒及高表達mRNA、蛋白質(zhì)，易回收和分析易培養(yǎng)、易轉(zhuǎn)染。CHO-K1細胞：1957年，Puck等從中國倉鼠卵巢分離，上皮樣細胞。

CHO-dhfr-

為二氫葉酸還原酶突變型(培養(yǎng)時需加入次黃嘌呤、胸苷)，用于工程細胞構(gòu)建。

4、融合細胞系

細胞融合：兩個或兩個細胞合并成一個細胞的過程。主要為雜交瘤細胞。

細胞自發(fā)融合的頻率很低，需要采用人工的方式進行細胞融合，方法有3種：生物方法（病毒）、化學(xué)方法（PEG）、物理方法（電融合）目前，常用的為PEG和電融合。（1）病毒誘導(dǎo)融合可促進細胞融合的病毒有：皰癥病毒、天花病毒、副流感病毒、副黏液病毒等。仙臺病毒為副黏液病毒的一種，對人危害小而且有效，使用最廣。起融合作用的為病毒被膜上的糖蛋白。細胞融合時加入滅活的仙臺病毒，兩個細胞在病毒的黏結(jié)作用下靠近，通過病毒與細胞膜的作用使兩個細胞膜相互融合。細胞融合率較低，而且還需病毒，現(xiàn)已很少使用。（2）PEG融合

誘導(dǎo)融合的機理還不明確。

PEG（聚乙二醇）為乙二醇的線性多聚體，結(jié)構(gòu)式為H(OCH2CH2)nOH，分子量1000以上為固體，1000以下為液體。用于細胞融合的PEG分子量一般為1000~6000，濃度為30~50%。融合效率最高可達10%。3、電融合

細胞在強電場脈沖的作用下，細胞膜上會短暫出現(xiàn)小孔，如果兩個細胞貼近，電脈沖時緊貼的質(zhì)膜會瞬時破裂而導(dǎo)致膜的融合，從而形成雜合細胞。優(yōu)點：融合率很高、對細胞毒性低、適合各種細胞、可用于細胞數(shù)量很少的融合過程。

細胞融合需要經(jīng)細胞膜融合、細胞質(zhì)滲透、細胞核融合等主要步驟。

預(yù)處理融合方法主要應(yīng)用動物細胞不需仙臺病毒、PEG、電融合生產(chǎn)單克隆抗體植物細胞脫壁PEG、電融合創(chuàng)造植物新品種微生物細胞脫壁PEG高產(chǎn)優(yōu)良新菌種5、重組工程細胞系構(gòu)建含目的基因的真核細胞表達載體（病毒載體、質(zhì)粒載體）導(dǎo)入動物細胞通過選擇標記篩選工程細胞瞬時表達穩(wěn)定表達生產(chǎn)上為了獲得高效穩(wěn)定表達的工程細胞株。

三、細胞庫的建立除原代細胞，其他細胞系或株需要建庫保存。原始細胞庫（mastercellbank，MCB）

二倍體細胞：群體倍增水平盡可能低的細胞（傳代次數(shù)盡可能少的細胞）記錄詳細檔案工作細胞庫（workingcellbank，WCB）

生產(chǎn)用細胞庫（manufacturer’sworkingcellbank，MWCB）

生產(chǎn)3.3動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基一、動物細胞的培養(yǎng)條件1、器材的清洗新的玻璃：泡酸（5%鹽酸12h）、刷洗、清潔液泡12h（重鉻酸鉀-硫酸洗液）、沖洗2、水質(zhì)新鮮的超純水、雙蒸水或三蒸水無熱原

3、pH值最適pH為7.2～7.4，低于6.8或高于7.6對細胞生長不利酚紅

細胞代謝產(chǎn)乳酸Na2HPO4/NaH2PO4、NaHCO3/CO2

HEPES(pKa7.6)10~50mMMOPS、DIPSO等。

4、滲透壓理想的滲透壓可保持在290～300mOsm(milli

-

osmol

)/kg，可通過增減NaCl的量調(diào)節(jié)。

1mg/mlNaCl32mOsm/kg1mol葡萄糖/kg水冰點-1.858

℃1000

mOsm/kg冰點-0.186

℃100

mOsm/kg

平衡鹽溶液（balancedsaltsolution，BSS）維持滲透壓、pH

5、溫度

哺乳動物細胞的最佳培養(yǎng)溫度為37±0.5℃，可在25～35℃生存和生長，40℃以上只能存活幾十分鐘到幾個小時。6、氧氣和二氧化碳二氧化碳主要調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，二氧化碳的比例可為3~5%；氧氣影響細胞生長，溶氧過高對細胞產(chǎn)生毒害，過低抑制細胞生長。可采用不同比例的氧氣、氮氣、二氧化碳和空氣加以調(diào)節(jié)。

7、抗生素

防止微生物污染可在培養(yǎng)基中加入一定量的抗生素。生產(chǎn)中不準使用青霉素和β-內(nèi)酰胺類抗生素。

8、器材的消毒滅菌

物理方法：濕熱、干熱、紫外線、伽馬射線、過濾。化學(xué)方法：化學(xué)消毒劑，主要用于空氣、表面滅菌消毒、污染物品處理。

二、動物細胞培養(yǎng)基

不同的動物細胞對培養(yǎng)基的要求差異很大，一般無規(guī)律可循，常需要花費很大的時間和精力確定適合的特定細胞需要的培養(yǎng)基。動物細胞培養(yǎng)基按組成大致可分為三類：天然培養(yǎng)基包括血清、淋巴液、胚胎浸取液等。成分復(fù)雜、組分不穩(wěn)定、來源有限。補充血清的合成培養(yǎng)基在一些合成培養(yǎng)基中添加5～20%血清而成。最常用的血清為小牛血清、胎牛血清，還有馬血清等。

合成培養(yǎng)基成分明確、組分穩(wěn)定，目前商品化的有幾十種（如MEM、DMEM、RPMI1640、199等），主要由成分包括：氨基酸必需氨基酸、半胱氨酸、酪氨酸及其他種類氨基酸；維生素能源物質(zhì)（葡萄糖、谷氨酰胺）無機鹽緩沖體系其他成分如核酸前體物質(zhì)（腺苷、鳥苷等）、脂類物質(zhì)等血清的作用：提供細胞生長所需的各種生長因子和激素提供細胞生長所需的貼附因子和伸展因子提供可識別金屬離子、激素、維生素、脂質(zhì)的結(jié)合蛋白提供細胞生長所必須的脂肪酸和微量元素。含血清培養(yǎng)基的缺點：血清的來源和批次不同導(dǎo)致培養(yǎng)差異血清的保存期有限血清很容易污染雜菌血清可能含病毒和支原體血清本身所含蛋白增加了產(chǎn)品的分離純化難度血清供應(yīng)問題成本高無血清的培養(yǎng)基在合成培養(yǎng)基中添加一些特殊成分而成：激素和生長因子(胰島素和表皮生長因子等)結(jié)合蛋白（鐵傳遞蛋白、白蛋白）帖附和伸展因子（纖維結(jié)合蛋白膠原、一些多肽）其他有利于細胞生長的因子和元素（谷胱甘肽、硒等）無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點：提高了細胞培養(yǎng)的重現(xiàn)性、減少了血清帶來的污染問題、供應(yīng)充足、產(chǎn)品易于純化。3.4動物細胞培養(yǎng)的基本方法一、動物細胞的生長過程大多數(shù)動物細胞為貼壁細胞，培養(yǎng)細胞的生長過程通常包括5個時期：1、游離期又稱懸浮期，細胞接種后在培養(yǎng)液為懸浮狀態(tài)，細胞為球形。10min～4h。2、貼壁期細胞附著在固體表面，在培養(yǎng)開始后10min～4h貼壁。細胞貼壁需要特殊的表面或其他物質(zhì)，如膠原、玻璃、塑料等。血清中含有促進細胞貼壁的球蛋白、膠原、纖黏素等糖蛋白（促貼壁因子），這些蛋白帶正電荷，先吸附于固體表面，細胞再吸附在這些促貼壁因子表面。

3、潛伏期細胞有生長活動，但無細胞分裂。6h～24h。4、對數(shù)生長期細胞活力最高，生長速度最快。5、停止期（平臺期）固體表面長滿細胞，細胞雖有活力但不再分裂。二、動物細胞培養(yǎng)的基本方法

1、細胞分離（1）離心分離從含有細胞體液中分離低速離心（800~1000rmp,5～10min）（2）消化分離組織塊－－剪碎－－消化液消化－－細胞懸液－－洗滌－－細胞消化液：胰蛋白酶、EDTA、胰酶-檸檬酸鹽、胰酶-EDTA、膠原酶等。

2、細胞計數(shù)（1）自動細胞計數(shù)器計數(shù)無法區(qū)分死活細胞無法區(qū)分單個細胞和細胞團

（2）血球計數(shù)板計數(shù)采用臺盼藍或苯胺黑染色后計數(shù)可區(qū)分死活細胞。（3）結(jié)晶紫染色細胞核計數(shù)法結(jié)晶紫染色液（結(jié)晶紫+檸檬酸）能使細胞分離破碎，細胞核染成藍色，在血球計數(shù)板計數(shù)細胞核即得細胞數(shù)。（4）MTT(四甲基偶唑鹽)染色計數(shù)MTT（淡黃）被活細胞線粒體脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿募自绿妫╢ormazan，紫色），溶于脫色液，比色從標準曲線得細胞數(shù)。

3、細胞傳代（1）懸浮細胞稀釋傳代

（2）貼壁細胞消化液（胰酶）消化－－－倒去消化液－－－加入含血清的培養(yǎng)基－－－傳代

4、細胞的凍存和復(fù)蘇（1）凍存液氮（-196℃

）保存凍存時細胞狀態(tài)良好密度1×106~2×106/ml

加10%DMSO(二甲基亞砜)或甘油降溫速度1℃/min

（2）復(fù)蘇快融從液氮罐中取出立即放入37~40℃水浴中。離心換液或解凍后直接加培養(yǎng)基培養(yǎng)，4～6h貼壁后立即換液。3.5動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法和操作方式一、動物細胞大規(guī)模的培養(yǎng)方法分為懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、假懸浮培養(yǎng)（微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)）等。

1、懸浮培養(yǎng)適用于非貼壁依賴性細胞，如雜交瘤細胞。適應(yīng)于兼性貼壁細胞。

Wellcome公司8000L攪拌罐生物反應(yīng)器培養(yǎng)Namalwa細胞產(chǎn)干擾素。

Celltech公司2000L氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細胞產(chǎn)單抗。2、貼壁培養(yǎng)細胞貼附在固體表面生長以單層膜的形式生長，適用于貼壁依賴性細胞與兼性貼壁細胞。

動物細胞一般帶負電、帶正電荷的固體表面較理想有利于粘附細胞。貼壁培養(yǎng)的材料可采用玻璃和一次性塑料（通常為聚苯乙烯）等。聚苯乙烯表面疏水，與細胞的相容性不好，經(jīng)過γ

射線、化學(xué)法和放電表面改性增強其表面電荷和浸潤性能，成為細胞培養(yǎng)的理想材料。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)1~5L的旋轉(zhuǎn)瓶簡單、比表面積小、勞動強度大。以貼壁培養(yǎng)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他操作方式可采用采用其他培養(yǎng)方式如微載體培養(yǎng)，中空纖維膜反應(yīng)器培養(yǎng)。3、微載體培養(yǎng)

微載體為直徑為100~250um，適用于貼壁細胞生長的球狀顆粒。微載體培養(yǎng)指將細胞貼附在微載體上進行懸浮培養(yǎng)。優(yōu)點：培養(yǎng)體系的比表面積大，可隨載體濃度的改變而改變，細胞培養(yǎng)密度較高培養(yǎng)體系均勻，培養(yǎng)重復(fù)性好培養(yǎng)基的利用率高取樣后很容易通過顯微鏡觀察載體表面的細胞生長狀況收獲細胞和細胞產(chǎn)物簡單放大容易對人工和空間的需求低

優(yōu)良的微載體一般要具有以下特性：載體表面與細胞相容性良好，帶較低的正電荷，適于細胞的附著和生長微載體的相對密度略大于培養(yǎng)基，在1.03~1.05之間，輕度攪拌就能時載體懸浮起來，停止攪拌很很快沉淀顆粒粒度分布均勻，表面光滑利于細胞鋪展載體透明，容易用顯微鏡直接對細胞觀察材料無毒性載體材料為非剛性材料，避免培養(yǎng)過程中相互碰撞損傷細胞可以高溫滅菌惰性，不吸收或少吸收培養(yǎng)基組分能重復(fù)使用，價廉

微載體的材料有聚苯乙烯、葡聚糖、纖維素、膠原等。

多孔微載體：極大增大了比表面積

加鈦載體（高比重，適用于流化床反應(yīng)器）普通載體

4、微囊化培養(yǎng)指將動物細胞包裹在親水的球狀半透性薄膜形成的微囊內(nèi)。營養(yǎng)成分能透過，但細胞不能出來。適用于貼壁依賴性細胞和非貼壁依賴性細胞。優(yōu)點：減少了攪拌、通氣對細胞的影響細胞在微小的環(huán)境中生長良好，能達到很高的細胞密度制備動物細胞微囊的材料通常為海藻酸鹽和多聚賴氨酸（分子量一般在40,000~80,000）。

海藻酸鹽是由D-甘露糖醛酸和L-古羅糖醛酸通過1,4糖苷鍵連接而成。動物細胞微囊化：海藻酸聚陰離子和聚賴氨酸聚陽離子形成聚電解質(zhì)的膜。

5.包埋培養(yǎng)采用各種凝膠進行包埋后培養(yǎng)，主要的凝膠載體為海藻酸凝膠、瓊脂糖等。動物細胞包埋后細胞活性不高，很少采用。6.結(jié)團培養(yǎng)某些結(jié)團生長的細胞細胞本身作為貼附基質(zhì),可加入直徑較小的顆粒（20um）促進結(jié)團

二、動物細胞培養(yǎng)的操作方式

分為分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)。

1、分批培養(yǎng)2、流加培養(yǎng)培養(yǎng)過程中反應(yīng)體積不斷增加。流加培養(yǎng)可以補充細胞消耗的營養(yǎng)物質(zhì)，使細胞在較長時間內(nèi)處于較好的環(huán)境中生長，有利于產(chǎn)物的形成和細胞濃度提高?？杀苊飧邼舛然|(zhì)對細胞生長的抑制作用。3、半連續(xù)培養(yǎng)

培養(yǎng)開始時為分批培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定程度，取出部分培養(yǎng)液，同時反應(yīng)器中補加相同的體積的培養(yǎng)基，再按分批操作的方式進行培養(yǎng)。又稱為反復(fù)分批培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。優(yōu)點：操作簡單、可反復(fù)收獲產(chǎn)品4、連續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)開始時為分批培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定程度后，連續(xù)不斷的補加新鮮培養(yǎng)基同時排出等量培養(yǎng)液。細胞生長的比生長速率和稀釋率相同時達到穩(wěn)態(tài)，細胞濃度和培養(yǎng)基中各種物質(zhì)濃度均保持不變。優(yōu)點：細胞的生長環(huán)境良好穩(wěn)定、可連續(xù)不斷獲得產(chǎn)品和細胞。5、灌流培養(yǎng)在細胞培養(yǎng)至一定程度后，將新鮮培養(yǎng)基不斷加入反應(yīng)器，同時將不含細胞的培養(yǎng)液不斷取出，細胞保留在反應(yīng)器內(nèi)。灌注培養(yǎng)可保持細胞良好的培養(yǎng)條件，不斷排出有害代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)細胞能達到很高的濃度，連續(xù)收獲產(chǎn)品。3.6動物細胞生物反應(yīng)器動物細胞培養(yǎng)規(guī)模較小，100L以上即為生產(chǎn)規(guī)模。1、轉(zhuǎn)瓶仍然用于一些病毒疫苗的生產(chǎn)和細胞種子培養(yǎng)。2、通氣攪拌式反應(yīng)器動物細胞不耐剪切力，而且培養(yǎng)基容易產(chǎn)生泡沫。用于動物細胞的攪拌式反應(yīng)器的通氣裝置和攪拌槳具有特殊的結(jié)構(gòu)，可用于動物細胞培養(yǎng)。聚丙烯中空纖維膜或薄硅膠管園底、高徑比1～1.5:13、氣升式反應(yīng)器

氣體通過反應(yīng)器底部的噴射管進入反應(yīng)器的導(dǎo)流筒，使得到流筒中的液體總體密度低于外部區(qū)域，從而一直上升，導(dǎo)致液體在反應(yīng)器中循環(huán)。高徑比大10:1。

氣泡直徑1~2mm

空氣流速0.01~0.06vvm

剪切力小，混合均一氧和營養(yǎng)的傳遞好有利于設(shè)備的密封

4、中空纖維膜反應(yīng)器由很多中空纖維膜（一般為超濾膜）組成的反應(yīng)器。結(jié)構(gòu)上分為管外空間和管內(nèi)空間，細胞在管外空間生長，貼壁細胞可貼在膜外表面生長，懸浮細胞可管外空間懸浮生長，培養(yǎng)基從中空纖維管內(nèi)通過，養(yǎng)分和溶氧通過膜的擴散到管外，代謝廢物擴散至管內(nèi)被帶走。用途較廣。細胞培養(yǎng)密度高108/ml

細胞分裂停止

代謝和分化功能可保持數(shù)月5、平板膜反應(yīng)器

懸浮細胞和貼壁細胞

6、流化床和固定床反應(yīng)器

3.7動物細胞產(chǎn)品制造實例一、類淋巴細胞干擾素(Na-IFN-α，interferonIFN)

由Namalva細胞（淋巴瘤患者中分離獲得）生產(chǎn)

攪拌罐生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)（8000L）80%IFN-α(多種亞型)＋20%IFN-β細胞逐級擴大培養(yǎng)（8000L）10%小牛血清RPMI16401×106/ml丁酸鈉或IFN啟動仙臺病毒誘生單抗或多抗親和層析TCA沉淀超濾濃縮收獲離心Na-IFN-α48h18hSephadexG75二、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）

人t-PA基因位于第8號染色體p12~q11.2區(qū)14個外顯子和13個內(nèi)含子全長36,594bp

t-PA為單鏈527aaMW67,000~72,000

等電點7.8~8.6,pH5.8~8.0穩(wěn)定17對二硫鍵三個糖基化位點

275Arg-276Ile

能被纖溶酶、組織激肽釋放酶作用裂解成雙鏈。作用機理：游離t-PA對纖溶酶原親和力很低，不產(chǎn)生激活作用。

t-PA對血栓中纖維蛋白有很