生物奧賽：-細(xì)菌及病毒的遺傳分析課件

第七章細(xì)菌及病毒的遺傳作圖第一節(jié)

細(xì)菌和病毒遺傳研究的意義第二節(jié)細(xì)菌基因重組第三節(jié)噬菌體的基因重組一、轉(zhuǎn)化(transformation)(一)、發(fā)現(xiàn)：1928年，F(xiàn).Griffith(二)、定義

某種基因型的細(xì)胞從周?chē)橘|(zhì)中吸收來(lái)自另一基因型細(xì)胞的DNA片段，而使自身的基因型和表現(xiàn)型發(fā)生相應(yīng)改變的現(xiàn)象。(三)、轉(zhuǎn)化過(guò)程*(四)共同轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜繪制(三)、轉(zhuǎn)化過(guò)程

轉(zhuǎn)化現(xiàn)象在細(xì)菌中是一種普遍現(xiàn)象。它們de共同特征：1.感受態(tài)：感受態(tài)指細(xì)菌能夠從周?chē)h(huán)境中吸收DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。一般認(rèn)為感受態(tài)出現(xiàn)在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，并且某些處理過(guò)程可以誘導(dǎo)或加強(qiáng)感受態(tài)，以大腸桿菌為例，如用Ca2+(如Call2)處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的大腸桿菌可以增強(qiáng)其感受能力。2.供體(donor)DNA與受體(receptor)細(xì)胞結(jié)合(binding)：結(jié)合發(fā)生在受體細(xì)胞特定部位(結(jié)合點(diǎn))；結(jié)合過(guò)程是一個(gè)可逆過(guò)程。3.DNA攝?。寒?dāng)細(xì)菌結(jié)合點(diǎn)飽和之后，細(xì)菌開(kāi)始攝取外源DNA；往往只有一條DNA單鏈進(jìn)入細(xì)胞(單鏈攝入)，另一條鏈在膜上降解。4.聯(lián)會(huì)(synapsis)與外源DNA片段整合(integration)：整合就是指單鏈的轉(zhuǎn)化DNA與受體DNA對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的置換，從而穩(wěn)定地?fù)饺氲绞荏wDNA中的過(guò)程。實(shí)際上就是一個(gè)遺傳重組的過(guò)程。細(xì)菌轉(zhuǎn)化過(guò)程轉(zhuǎn)化結(jié)果外源DNA未整合——流產(chǎn)轉(zhuǎn)化，外源DNA被稀釋?zhuān)荒艿玫睫D(zhuǎn)化子；外源DNA整合——成功轉(zhuǎn)化，可得到轉(zhuǎn)化子復(fù)制時(shí)以原來(lái)受體的DNA為模板，復(fù)制后代表型不變；復(fù)制時(shí)以供體的DNA為模板，復(fù)制后代表型改變*(四)、共同轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜繪制

利用共同轉(zhuǎn)化繪制細(xì)菌連鎖遺傳圖譜的基本原理：相鄰基因發(fā)生共同轉(zhuǎn)化的概率與兩者的距離間成正向關(guān)系，基因間距離越近，發(fā)生共同轉(zhuǎn)化的頻率越高，反之越低。因此可能通過(guò)測(cè)定兩基因共同轉(zhuǎn)化的頻率來(lái)指示基因間的相對(duì)距離。提取基因型為ABC的菌株的DNA來(lái)轉(zhuǎn)化基因型為abc的菌株，得到下列轉(zhuǎn)化子：

Abc、aBc、ABc、abC、aBC，判斷a、b、c基因的順序。abc二、接合(一)、接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)(二)、遺傳物質(zhì)的單方向轉(zhuǎn)移(三)、F因子的發(fā)現(xiàn)(四)、F因子及其在雜交中的行為(五)、F?因子與性導(dǎo)(sexduction)(一)、接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)

1946年，J.Lederberg和Tatum大腸桿菌雜交試驗(yàn)：材料：大腸桿菌K12菌株的兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型品系：A—甲硫氨酸缺陷型met-和生物素缺陷型bio-；B—蘇氨酸缺陷型thr-、亮氨酸缺陷型leu-和硫氨素缺陷型thi-。方法：將A、B混和于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，離心洗滌，在基本培養(yǎng)基(固體)上涂布培養(yǎng)。結(jié)果：平板上長(zhǎng)出原養(yǎng)型菌落(++++)，概率10-7。這種原養(yǎng)型細(xì)胞的出現(xiàn)是：1回復(fù)突變？2轉(zhuǎn)化？3細(xì)胞與細(xì)胞直接接觸而發(fā)生的遺傳物質(zhì)交換和重組？

為了解答這個(gè)問(wèn)題，Davi(1950)設(shè)計(jì)了U型管實(shí)驗(yàn)。

回復(fù)突變可能的排除Lederberg和Tatum利用的雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行試驗(yàn)，已基本排除A或B品系發(fā)生回復(fù)突變產(chǎn)生原養(yǎng)型細(xì)菌的可能。單基因回復(fù)突變的頻率約為10-6；雙基因回復(fù)突變的頻率則為10-12，頻率很低。但試驗(yàn)中產(chǎn)生原養(yǎng)型菌落產(chǎn)生的頻率非常高，因此基本可以排除回復(fù)突變的可能。轉(zhuǎn)化作用及其排除

Lederbery和Tatum曾把品系A(chǔ)的培養(yǎng)液經(jīng)加熱殺菌，加入到B品系的培養(yǎng)物中，未得到原養(yǎng)型菌落；表明原養(yǎng)型菌落可能不是由轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生。戴維斯(Dawis,1950)的U型管試驗(yàn)；濾片孔徑很小，可讓DNA、0.1μm的游離分子和更小的營(yíng)養(yǎng)物通過(guò)，但細(xì)胞不能直接接觸。(結(jié)果沒(méi)有得到原養(yǎng)型細(xì)菌)實(shí)驗(yàn)結(jié)論：細(xì)胞直接接觸是原養(yǎng)型細(xì)菌產(chǎn)生的必要條件。(二)遺傳物質(zhì)的單方向轉(zhuǎn)移W.Hayes(1952)高劑量鏈霉素處理A品系或B品系然后做雜交實(shí)驗(yàn)（鏈霉素不殺死細(xì)胞，只是阻止細(xì)胞分裂）鏈霉素處理A品系×B品系，雜交結(jié)果不受影響；A品系×鏈霉素處理B品系，無(wú)雜交后代產(chǎn)生。研究表明：大腸桿菌兩種不同菌株(品系)接合過(guò)程中遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是單向的；從而認(rèn)為大腸桿菌存在兩種類(lèi)型品系：雌性與雄性分別作為接合過(guò)程中遺傳物質(zhì)的供體與受體。接合(conjugation)：

通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞直接接觸，使遺傳物質(zhì)從供體(donor)轉(zhuǎn)移到受體(receptor)的重組過(guò)程。兩個(gè)E.Coli

細(xì)胞雜交的電子顯微鏡照片(X34,300)

F因子及其在雜交中的行為

1.F因子：F因子就是F質(zhì)粒，其化學(xué)本質(zhì)是DNA，約為細(xì)菌染色體全長(zhǎng)的2%。F+品系與F－品系F+與F－品雜交后代變?yōu)镕+頻率很高。質(zhì)粒：細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì)，可自主復(fù)制。3.F因子的存在狀態(tài)

附加體(episome)：既能整合到染色體上隨染色體復(fù)制而傳遞，又能獨(dú)立游離細(xì)胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)。4..F因子及其在雜交中的行為

4.F因子及其在雜交中的行為

部分二倍體：一個(gè)完整的基因組和一個(gè)不完整的基因組所構(gòu)成的二倍體。其中受體的基因組叫內(nèi)基因子，供體的基因組叫外基因子。F因子及其在雜交中的行為

2.高頻重組品系（Hfr）1951年，LucaCavalli-Sforza偶然發(fā)現(xiàn)，用氮芥處理A品系后從存活的細(xì)菌中分離出一種新品系，將這種新品系和經(jīng)典的B品系雜交，得到的重組體比一般雜交高出一千倍，稱(chēng)為高頻重組品系Hfr。Hayes(1954)也從F+品系分離出Hfr新品系HfrC和HfrH.Hfr和F+的異同相同1.都能和F-進(jìn)行雜交產(chǎn)生重組后代；2.雜交時(shí)都要通過(guò)接合管和受體菌相連接；3.用高劑量鏈霉素處理后都不影響雜交，說(shuō)明它們都是作為一種供體。不同1.產(chǎn)生的重組子頻率不同；10-4，10-72.F+×F-后代常為F+，而Hfr×F-后代絕大多數(shù)為F-Wollman和Jacob想了解Hfr雜交時(shí)，什么時(shí)候把致育基因傳給F－，設(shè)計(jì)了中斷雜交試驗(yàn)，該試驗(yàn)對(duì)大腸桿菌遺傳研究有重大突破。中斷雜交試驗(yàn)1Hfr：thr+leu+strsazirtonrlac+gal+F－

：thr－leu－strrazistonslac－gal－

二者混合于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，把菌液用組織搗碎器猛烈攪拌，中斷雜交，樣品稀釋分別涂到含鏈霉素的基本培養(yǎng)基上，再影印培養(yǎng)用不同選擇培養(yǎng)基鑒別基因型。

基本+azi

基本+T1乳糖為唯一碳源半乳糖為唯一碳源

8min－－－－

9min＋－－－

11min＋＋－－

18min＋＋＋－

25min＋＋＋＋中斷雜交試驗(yàn)2中斷雜交試驗(yàn)3Hfr上基因以一定順序先后轉(zhuǎn)移到F－。轉(zhuǎn)移從一端開(kāi)始，即從原點(diǎn)O開(kāi)始。以線性方式進(jìn)入F－?；螂x原點(diǎn)越近，進(jìn)入F－越早，轉(zhuǎn)移頻率越高；反之進(jìn)入F－越晚，轉(zhuǎn)移頻率越低。假設(shè)基因傳遞速度均勻，進(jìn)入F－時(shí)間越早，則離原點(diǎn)越近，據(jù)此可作出Hfr上基因分布圖。Oazi

ton

lacgal9111824如讓雜交持續(xù)兩小時(shí)，然后中斷，一些F－變?yōu)镕+，說(shuō)明F因子最后轉(zhuǎn)移。大腸桿菌環(huán)狀染色體Wollman和Jacob用不同Hfr品系做了大量中斷雜交來(lái)確立大腸桿菌基因連鎖圖。

從試驗(yàn)中可知：大腸桿菌染色體為環(huán)狀。Hfr品系基因順序

1thrprolac

purgalhisgly

thi2thr

thi

glyhisgalpur

lacpro3prothr

thi

glyhisgalpur

lac4pur

lacprothr

thi

glyhisgal5thi

thrprolac

purgalhisglythrprolacpurgalhisglythiHfr1Hfr2Hfr3Hfr4Hfr5大腸桿菌環(huán)狀染色體圖傳統(tǒng)作圖法

Hfr：lac+ade+×F-

：lac－ade－

重組值=lac－ade+

/ade+*100%=20%中斷雜交實(shí)驗(yàn)lac-ade相距1分鐘三、性導(dǎo)——概念（一）F?因子Hfr菌株在切除F因子時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤切除，分離出一個(gè)攜帶F因子和部分宿主染色體基因的遺傳因子，這種帶有宿主染色體基因的F因子稱(chēng)為F?因子。（二）性導(dǎo)帶有F?因子的細(xì)菌在接合時(shí)，由F?因子所攜帶的外源DNA轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)菌的染色體的過(guò)程稱(chēng)為性導(dǎo)。（三）F’因子的特點(diǎn)①F’因子以極高的比率轉(zhuǎn)移它攜帶的基因；如同F(xiàn)+高效轉(zhuǎn)移F因子一樣。②F’因子有極高的自然整合率，而且整合在一定的基因座位上，因有與細(xì)菌同源的染色體區(qū)段，不同于F因子隨機(jī)插入。F+、Hfr、F’三者關(guān)系

F’因子以極高的比率轉(zhuǎn)移它攜帶的基因；如同F(xiàn)+高效轉(zhuǎn)移F因子一樣。

F’因子有極高的自然整合率，而且整合在一定的基因座位上，因有與細(xì)菌同源的染色體區(qū)段，不同于F因子隨機(jī)插入。

F+×F-

后代常為F+，而Hfr×F-

可以把細(xì)菌染色體高頻率轉(zhuǎn)移F-，但后代絕大多數(shù)為F-

。三、病毒的種類(lèi)根據(jù)宿主劃分：微生物病毒植物病毒無(wú)脊椎動(dòng)物病毒脊椎動(dòng)物病毒亞病毒類(lèi)病毒擬病毒朊病毒細(xì)菌病毒一般稱(chēng)為噬菌體（phage）亞病毒：１定義：凡在核酸和蛋白質(zhì)兩種分子中，只含其中之一的分子病原體。２種類(lèi)：類(lèi)病毒、擬病毒、朊病毒類(lèi)病毒：只含ＲＮＡ一種成分專(zhuān)性寄生在活細(xì)胞內(nèi)的分子病原菌。

類(lèi)病毒1971年從患馬鈴薯紡錘形塊莖病的病薯中分離出的一個(gè)病原體，呈棒形結(jié)構(gòu)，是一個(gè)裸露的閉合環(huán)狀單鏈RNA分子，沒(méi)有蛋白質(zhì)外殼，分子量比一般病毒分子更小，稱(chēng)為類(lèi)病毒。嚴(yán)格專(zhuān)性寄生，只有在宿主細(xì)胞內(nèi)才表現(xiàn)出生命特征，可使植物致病或死亡。類(lèi)病毒的復(fù)制機(jī)制迄今為止還不十分清楚。

擬病毒：是指一類(lèi)包裹在真病毒粒中的有缺陷的類(lèi)病毒。（類(lèi)類(lèi)病毒、殼內(nèi)病毒、病毒衛(wèi)星）。

極其微小，由裸露的ＲＮＡ或ＤＮＡ組成。其寄主叫輔助病毒。擬病毒復(fù)制依賴(lài)輔助病毒的協(xié)助，擬病毒干擾輔助病毒的復(fù)制和減輕其對(duì)寄主的病害。

擬病毒的發(fā)現(xiàn)：從絨毛煙的斑駁病毒分離的（１９８１年）。動(dòng)物擬病毒：丁型肝炎病毒（ssＲＮＡ）。輔助病毒為乙肝病毒（ＨＢＶ）。朊粒(傳染性蛋白質(zhì)顆粒)

羊的瘙癢癥瘋牛病中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病人的克魯病(kuru)和克-雅氏癥(v-CJD)

PrP基因—正常糖蛋白PrPc

—構(gòu)象變化–PrPsc(有感染性)

朊粒是正常寄主的PrP基因編碼的正常蛋白質(zhì)PrPc的異構(gòu)體PrPsc.PrPc的結(jié)構(gòu)是以α螺旋為主。PrPsc異構(gòu)體以β折疊片為主。PrPsc進(jìn)入細(xì)胞與PrPc結(jié)合，使之變?yōu)镻rPsc造成后者劇增，在神經(jīng)細(xì)胞中沉積，引起神經(jīng)退行性病變，其潛伏期是4-5年，最長(zhǎng)可達(dá)40年。出現(xiàn)癥狀一般一年內(nèi)100%死亡。噬菌體的類(lèi)型根據(jù)噬菌體的生活周期可分為：（一）烈性噬菌體（virulentphage）侵入宿主細(xì)胞后，利用宿主細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)進(jìn)行自身遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)的合成，組裝出子噬菌體，使宿主細(xì)胞裂解而釋放子噬菌體，這類(lèi)噬菌體