化學發(fā)光免疫檢驗技術（免疫學檢驗課件）

第二十一章

化學發(fā)光免疫技術本章要點化學發(fā)光劑的概念及常用的化學發(fā)光劑。1化學發(fā)光免疫分析的基本原理及其技術類型。2化學發(fā)光酶免疫分析基本原理及其分離技術。3電化學發(fā)光免疫分析基本原理。4化學發(fā)光免疫技術的臨床應用。5CONTENTS目錄發(fā)光基本知識化學發(fā)光免疫分析化學發(fā)光酶免疫分析電化學發(fā)光免疫分析化學發(fā)光免疫技術的臨床應用0102030405前言化學發(fā)光免疫技術是將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與高特異性的抗原抗體反應技術相結合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、維生素和藥物等的檢測分析技術。該技術具有特異性高、靈敏度高、分離簡便、快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、可自動化分析等特點，在免疫學檢驗中應用廣泛。前言放射免疫技術酶免疫技術熒光免疫技術金免疫技術化學發(fā)光免疫技術標記免疫技術發(fā)光基本知識01發(fā)光基本知識發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由低能級的基態(tài)躍遷到高能級的激發(fā)態(tài)，然后再返回到基態(tài)，釋放出的能量表現為光的發(fā)射。根據形成激發(fā)態(tài)的激發(fā)能不同可將發(fā)光分為光照發(fā)光、生物發(fā)光和化學發(fā)光。一、發(fā)光發(fā)光基本知識（一）光照發(fā)光（photoluminescence）發(fā)光劑（熒光素）經短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。發(fā)光基本知識（二）生物發(fā)光（bioluminescence）發(fā)生在生物體內的發(fā)光現象，如螢火蟲的發(fā)光，反應底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP產能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復基態(tài)時多余的能量以光子的形式釋放出來。熒火蟲熒光素氧化熒火蟲熒光素熒光素酶光發(fā)光基本知識（三）化學發(fā)光（chemiluminescence）某些物質(發(fā)光劑)在化學反應時，吸收了反應過程中所產生的化學能，使反應的產物分子或中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現象稱為化學發(fā)光。發(fā)光基本知識一個化學反應要產生化學發(fā)光現象，必須滿足以下條件：該反應必須提供足夠的激發(fā)能,并由某一步驟單獨提供,因為前一步反應釋放的能量將因振動弛豫消失在溶液中而不能發(fā)光。要有有利的反應過程,使化學反應的能量至少能被一種物質所接受并生成激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)分子必須具有一定的化學發(fā)光量子效率釋放出光子,或者能夠轉移它的能量給另一個分子使之進入激發(fā)態(tài)并釋放出光子。123發(fā)光基本知識二、化學發(fā)光劑在化學發(fā)光反應中參與能量轉移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物稱為化學發(fā)光劑或發(fā)光底物。作為化學發(fā)光免疫技術的化學發(fā)光劑應符合以下幾個條件：發(fā)光的量子產率高。物理-化學特性要與被標記或測定的物質相匹配。能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯結合物。其化學發(fā)光常是氧化反應的結果。在所使用的濃度范圍內對生物體沒有毒性。發(fā)光基本知識常用的化學發(fā)光劑或發(fā)光底物有：直接化學發(fā)光劑酶促反應的發(fā)光底物電化學發(fā)光劑二、化學發(fā)光劑發(fā)光基本知識（一）直接化學發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應，它們在化學結構上有產生發(fā)光的特有基團，可直接標記抗原或抗體。如常用的吖啶酯（acridinium，AE）。發(fā)光基本知識吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時,發(fā)出波長為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應體系的發(fā)光體。發(fā)光基本知識（二）酶促反應的發(fā)光底物是利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光。目前化學發(fā)光酶免疫技術中常用的酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）。HRP的常用的發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物，ALP的發(fā)光底物為金剛烷（AMPPD）。發(fā)光基本知識（1）魯米諾或其衍生物

魯米諾在堿性條件下可被一些氧化劑氧化，發(fā)生化學發(fā)光反應，輻射出最大發(fā)射波長為425nm的光。魯米諾激發(fā)態(tài)二價陰離子氨基酞酸鹽光熒光激發(fā)光強度發(fā)光基本知識魯米諾增強發(fā)光反應原理發(fā)光基本知識（2）AMPPD〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕〕堿性磷酸酶金剛烷酚鹽光AMPPD發(fā)光反應原理發(fā)光基本知識（三）電化學發(fā)光劑電化學發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)光的物質。如化學發(fā)光劑三聯吡啶釕[Ru(bpy)3]2+和電子供體三丙胺（TPA）在陽性電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應。化學發(fā)光免疫分析02化學發(fā)光免疫分析一、檢測原理用化學發(fā)光劑（如吖啶酯）直接標記抗體(抗原)，與待測標本中相應的抗原(抗體)和磁顆粒性的抗體（抗原）發(fā)生免疫反應后，通過磁場把結合狀態(tài)和游離狀態(tài)的化學發(fā)光劑標記物分離開來，這時只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內所產生的光子能，可從標準曲線上計算出待測抗原(抗體)的含量?；瘜W發(fā)光免疫分析化學發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖化學發(fā)光免疫分析二、方法類型分離方法常用磁顆粒分離技術，即用抗原或抗體包被磁顆粒，與標本中相應抗體或抗原及吖啶酯標記的抗體或抗原通過一定模式的免疫學反應后,最終通過在磁場中沖洗將結合到免疫復合物中的標記物和游離標記物進行分離的技術。1化學發(fā)光免疫分析二、方法類型常用的免疫學反應模式雙抗體夾心法雙抗原夾心法固相抗原競爭法2化學發(fā)光免疫分析三、技術要點抗原抗體結合反應結合物與游離物的分離(磁顆粒分離技術)抗原抗體結合反應化學發(fā)光酶免疫分析03化學發(fā)光酶免疫分析化學發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）是用參與催化某一化學發(fā)光反應的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應的抗體(抗原)發(fā)生免疫反應后，經洗滌將結合物與游離的酶標物分離后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統接收，光電倍增管將光信號轉變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數據處理系統，計算出測定物的濃度。一、檢測原理化學發(fā)光酶免疫分析堿性磷酸酶化學發(fā)光酶免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖洗滌清除抗體包被的磁珠抗原堿性磷酸酶標記抗體雙抗體夾心復合物雙抗體夾心復合物AMPPDAMPPD發(fā)光化學發(fā)光酶免疫分析二、方法類型根據標記酶不同分類可分為辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光酶免疫分析和堿性磷酸酶標記的化學發(fā)光酶免疫分析。前者常以魯米諾或其衍生物作為發(fā)光底物，后者常以AMPPD作為發(fā)光底物。1化學發(fā)光酶免疫分析二、方法類型根據免疫學反應模式分類同化學發(fā)光免疫分析，主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競爭法等主要模式，所不同只是相應抗原或抗體上標記的是酶而不是直接標記發(fā)光劑。2化學發(fā)光酶免疫分析三、技術要點抗原抗體結合反應結合物與游離物的分離(磁顆粒分離法、微粒子捕獲法、包被聚苯乙烯反應珠或孔分離法)酶促發(fā)光反應電化學發(fā)光免疫分析04電化學發(fā)光免疫分析一、檢測原理電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA）是以電化學發(fā)光劑三聯吡啶釕標記抗體(抗原)，通過抗原抗體反應和磁珠分離技術，根據三聯吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的抗原或抗體進行定量分析，它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。電化學發(fā)光免疫分析電化學發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖抗體包被的磁珠抗原RU(bpy)32+標記抗體引入TPA緩沖液TPA電子供體RU(bpy)32+發(fā)光電化學發(fā)光免疫分析電化學發(fā)光免疫測定示意圖抗原抗體結合的磁性微粒光電倍增管電極電極流動測量池液體流向磁鐵激發(fā)區(qū)工作電極未結合標記抗體電化學發(fā)光免疫分析二、方法類型分離方法：常用磁顆粒分離技術。免疫學反應模式：其反應模式同發(fā)光免疫分析，主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競爭法三種主要模式，所不同只是相應抗原或抗體上標記的是三聯吡啶釕。12電化學發(fā)光免疫分析三、技術要點抗原抗體反應結合物與游離物的分離(磁顆粒分離技術)電化學發(fā)光過程化學發(fā)光免疫技術的臨床應用05化學發(fā)光免疫技術的臨床應用一、化學發(fā)光免疫技術的特點敏感度高，甚至超過RIA；精密度和準確性均可與RIA相比；試劑穩(wěn)定，無毒害；測定耗時短；測定項目多；已發(fā)展成自動化測定系統。123456化學發(fā)光免疫技術的臨床應用二、化學發(fā)光免疫技術常見的檢測項目甲狀腺激素：T3、T4、hTSH、FT4、FT3、抗TPO、甲狀腺球蛋白、抗甲狀腺球蛋白抗體等。生殖激素：β-HCG、催乳素、促卵泡激素、促黃體激素、孕酮、雌二醇、非結合雌三醇、甲胎蛋白、睪丸酮、硫酸脫氫異雄酮。腎上腺/垂體激素：皮質醇、尿皮質醇、人生長激素、甲狀旁腺素、促腎上腺皮質激素。123化學發(fā)光免疫技術的臨床應用二、化學發(fā)光免疫技術常見的檢測項目貧血因子：維生素B12、葉酸、紅細胞葉酸、鐵蛋白等。腫瘤標記物：AFP、CEA、PSA、游離PSA、CAl9-9、CAl25、CAl5-3等。感染性疾?。阂略w抗原、尿衣原體抗原、衣原體抗原確認、弓形體IgG抗體、弓形體IgM抗體、風疹病毒IgG抗體、風疹病毒IgM抗體、巨細胞病毒IgG抗體、巨細胞病毒IgM抗體等。456化學發(fā)光免疫技術的臨床應用二、化學發(fā)光免疫技術常見的檢測項目糖尿病：胰島素、C肽等。心血管系統：肌酸激酶MB同工酶、地高辛、肌紅蛋白、心肌肌鈣蛋白-I等。病毒標記物：HIVl/2Ab、HBsAg、HBsAg確認、HBsAb、HCVAb、HAV、IgM、HAVAb、HBcAb、HBclgM、HBeAg、HBeAb等。789