免疫組織化學(xué)分析

免疫組織化學(xué)分析第1頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月第一部分基本知識(shí)第2頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫組織化學(xué)的歷史、現(xiàn)狀和發(fā)展

疾病的診斷手段準(zhǔn)確性，首推病理診斷準(zhǔn)確性高，即病理組織學(xué)診斷。更準(zhǔn)確、更可信、更有權(quán)威性。1974年免疫組化用于病理診斷免疫組織化學(xué)已成為病理診斷中的一種常用手段隨著免疫學(xué)和單抗技術(shù)的發(fā)展，免疫組化技術(shù)興起診斷免疫組化開始于70年代，發(fā)展高峰在80年代，90年代已在國外病理科列入病理技術(shù)室的常規(guī)工作。國內(nèi)病理科約晚10年的進(jìn)程，90年代開始在診斷病理工作中普及第3頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫組織化學(xué)在臨床上的應(yīng)用(1)提高病理診斷準(zhǔn)確性(2)對(duì)疾病的預(yù)后和治療的意義激素(3)癌基因蛋白的應(yīng)用(4)對(duì)腫瘤增生程度的評(píng)價(jià)(5)微小病灶的發(fā)現(xiàn)微小癌，微小病灶（如羊水栓塞）(6)在腫瘤分期上的意義(7)指導(dǎo)腫瘤的治療(8)免疫性疾病的輔助診斷(9)病原微生物的檢測(cè)第4頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫組化與抗體鑒定抗體上游鑒定方法:存在否?量多少?

免疫印跡、免疫沉淀、免疫電泳、免疫酶連抗體下游鑒定方法:價(jià)值體現(xiàn)IIF:間接免疫熒光技術(shù),系IF的一種,步驟很簡單,特點(diǎn)為敏感性好,對(duì)于低濃度抗體檢出率高于以下兩種方法.IHC:免疫組織化學(xué)技術(shù),方法不少,但具體操作基本相同,掌握一種就夠用了。ICC:免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),同上，組織換成細(xì)胞，但是處理方法不一樣了。下頁圖示第5頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫組化的各種方法第6頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月IHC技術(shù)是目前常規(guī)病理診斷和臨床治療中必不可少的手段，按照美國FDA標(biāo)準(zhǔn)，IHC抗體試劑系統(tǒng)分三類：A類抗體進(jìn)行病理鑒別診斷，B類抗體指導(dǎo)臨床治療，如ER/PR和AR，C類抗體顯示臨床用藥的靶細(xì)胞，要求試劑的安全性和穩(wěn)定性很高，此類抗體篩選要求有嚴(yán)格的內(nèi)部和外部對(duì)照。第7頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫組化實(shí)驗(yàn)涉及的幾個(gè)方面

1病理醫(yī)師：把握和選擇，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定，2實(shí)驗(yàn)員：準(zhǔn)備片子和試劑，了解基本原理也很重要，會(huì)做也要會(huì)分析3組織處理4試劑是否可靠，實(shí)驗(yàn)方法是否正確5實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)立：許多實(shí)驗(yàn)室忽略了這個(gè)要素。第8頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月第二部分實(shí)驗(yàn)技術(shù)第9頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫組化染色基本技術(shù)正式實(shí)驗(yàn)前做HE染色確認(rèn)片子質(zhì)量，厚度3-4um，目的細(xì)胞形態(tài)完好，沒有過多的壞死、出血、變性組織等，以免實(shí)驗(yàn)完畢后發(fā)現(xiàn)片子質(zhì)量不好，浪費(fèi)試劑和物力1常規(guī)處理：烤片，脫蠟，入水2抗原修復(fù)：3封閉處理：封閉組織內(nèi)源性酶，封閉組織非特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)，其他封閉4抗體反應(yīng)：一抗，二抗，三抗5顯色反應(yīng)：DAB，AEC，BCIP/NBT6后續(xù)處理：復(fù)染/分化/返蘭，脫水，透明，封片相關(guān)知識(shí)：HE染色第10頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月相關(guān)知識(shí)：HE染色蘇木素—伊紅染色是形態(tài)學(xué)常用的染色方法，取自Hematoxyln和Eosin單詞，簡稱HE染色，蘇木素將細(xì)胞核染成藍(lán)色，伊紅將細(xì)胞漿染成紅色，顯示組織和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)將各種組織細(xì)胞成分與病變區(qū)分開來。HE染色是臨床病理診斷的方法。HE與IHC配合可以確診疾病第11頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月相關(guān)知識(shí)：HE示意圖第12頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月相關(guān)知識(shí)：HE與IHC染色第13頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）

良好的標(biāo)本制備，免疫組化成功的首要條件免疫組化對(duì)組織和細(xì)胞標(biāo)本的要求

-保持所檢標(biāo)本原有的結(jié)構(gòu)、形態(tài)；

-在原位最大程度地保持待測(cè)抗原(或抗體)的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。免疫組化中常用的組織和細(xì)胞標(biāo)本

*組織標(biāo)本*細(xì)胞標(biāo)本

石蠟切片組織印片冰凍切片細(xì)胞涂片

細(xì)胞爬片

第14頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

*石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法

-最大優(yōu)點(diǎn)是組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；這點(diǎn)對(duì)于我們來說非常重要！

-石蠟塊還能長期存檔，供回顧研究。

*石蠟切片制作過程對(duì)組織內(nèi)抗原顯現(xiàn)有一定的影響，但可通過某些措施予以改善，因而它是大多數(shù)免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。第15頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月切片的準(zhǔn)備：APES，多聚賴胺酸剛切的石蠟片至少在58-60℃考2h以上（防止脫片），可以放置一段時(shí)間，實(shí)驗(yàn)前再烤30min即可。不可高溫烤片（80℃），會(huì)導(dǎo)致組織抗原氧化而難以檢測(cè)。切片保存：不可長時(shí)間室溫或冰箱里保存切片，抗原會(huì)丟失，原則上切片最多可放3個(gè)月。背景：有些研究人員或技術(shù)員喜歡一次性連續(xù)切上大量片子，然后放置保存，留做實(shí)驗(yàn)

第16頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

常規(guī)的石蠟切片標(biāo)本均用甲醛（福爾馬林）固定，結(jié)果使得：

-抗原性物質(zhì)形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；

-蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。*要求：在染色時(shí)，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。

因?yàn)槭炂M織含有石蠟，并且組織處于脫水的狀態(tài)，所以在實(shí)驗(yàn)前期要進(jìn)行相應(yīng)處理，即二甲苯脫蠟和梯度酒精水化（從無水乙醇逐漸下行到75%酒精的過程，入水）下一步：抗原修復(fù)第17頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）

恰當(dāng)?shù)目乖迯?fù)，會(huì)很大程度上改變最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果抗原修復(fù)方法

化學(xué)方法：胃蛋白酶，胰蛋白酶

加熱方法

-水浴加熱法

-微波照射法

-高壓加熱法

酸水解法以抗原修復(fù)效果而言，高壓法﹥微波法﹥化學(xué)方法﹥酸水解法﹥水煮法

細(xì)胞片和冰凍切片不需要抗原修復(fù)，但需要封閉步驟第18頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

微波法

*將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，置微波爐加熱至95℃以上，持續(xù)l0～15分鐘，冷卻后，按免疫組化染色步驟進(jìn)行。高壓法

*將玻片浸入抗原修復(fù)液內(nèi)，置高壓鍋中高壓1～2min，可取得極好的效果。

*由于高壓下受熱均勻，特別使用于大批量標(biāo)本的染色。

注意事項(xiàng)

加熱后必須經(jīng)過室溫自然冷卻20～30分鐘，使未折疊的蛋白分子鏈恢復(fù)天然構(gòu)型；

*修復(fù)液最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液；

下一步；封閉處理

第19頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）

封閉處理，降低非特異性染色的必要程序這個(gè)步驟在抗原修復(fù)之后，主要有三個(gè)封閉如果最后的顯色系統(tǒng)采用HRP（辣根過氧化物酶），則需要以0.3-3%的H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，否則組織中血液系統(tǒng)的細(xì)胞會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果如果檢測(cè)系統(tǒng)（二抗或者三抗）以生物素作為標(biāo)記，則需要封閉內(nèi)源性生物素（有專門試劑），否則肝、腎、甲狀腺等組織容易出現(xiàn)假陽性。常規(guī)的非免疫血清（正常血清）封閉。下一步：抗體反應(yīng)第20頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）

抗體反應(yīng)，關(guān)鍵在于設(shè)置適當(dāng)?shù)膶?duì)照1陰性對(duì)照：抗體稀釋液2陽性對(duì)照：兩個(gè)方面（陽性組織細(xì)胞、陽性抗體）3抑制對(duì)照4吸收對(duì)照5自身對(duì)照（內(nèi)對(duì)照）6同型對(duì)照；同種屬來源的純IgG或其亞型7無關(guān)對(duì)照；其他抗體在病理科的日常診斷工作中，只要有陰性對(duì)照和陽性對(duì)照即可。第21頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月除一抗以外，配套的抗體檢測(cè)試劑盒種類很多，這些試劑盒本身附帶有詳細(xì)的操作說明，如二步法、三步法等，同時(shí)會(huì)建議如何選擇配套的顯色系統(tǒng)。特殊類型的一抗，例如嵌合抗體，則選擇特殊的配套試劑盒或二抗。即用型與濃縮型抗體關(guān)于一抗的孵育時(shí)間：

37℃1h4℃過夜可以根據(jù)實(shí)際需要安排

下一步；顯色反應(yīng)第22頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）

顯色系統(tǒng)與顯色控制，決定實(shí)驗(yàn)效果目前最常用的顯示劑顯色試劑顏色

DAB棕黃色

AEC磚紅色

AP-Red鮮紅色

Fast-Blue亮綠色

BCIP/NBT蘭色前兩種用于辣根過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)后三種用于堿性磷酸酶（AP）系統(tǒng)評(píng)價(jià)：AEC顯色物溶于酒精和二甲苯，所以封片時(shí)不能用中性樹膠，以免褪色，而只能用甘油明膠或市售的AEC封片劑，采用該種試劑顯色的片子不能長期保存，不利于回顧性研究。

DAB顯色較快，鏡下控制比較容易，保存方便，實(shí)驗(yàn)結(jié)果比AEC顯色者清晰，為IHC首選顯色試劑。

BCIP/NBT顯色系統(tǒng)主要用于原位分子雜交實(shí)驗(yàn)，免疫組化可以選用。其缺點(diǎn)是不能用蘇木素復(fù)染（不能染核），但是可以用其他染料代替，比如核快紅等。第23頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月三種顯色系統(tǒng)效果圖

左上AEC左下BCIP/NBT右DAB第24頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月（六）

顯色后處理步驟，關(guān)系片子的外觀和內(nèi)觀復(fù)染，分化，返蘭前面已經(jīng)強(qiáng)調(diào)過，石蠟片子在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)過了脫蠟和水化處理，即二甲苯先脫蠟，然后沿?zé)o水乙醇逐漸到75%酒精。實(shí)驗(yàn)完畢后，則必須沿著上面順序反向走一遍，目的是脫水和透明，使得組織細(xì)胞清晰和易于保存，同時(shí)也去掉一些附著于片子上的雜質(zhì)注意：適用于DAB和BCIP/NBT顯色系統(tǒng)，AEC不可（？）。強(qiáng)調(diào)：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程不能干片第25頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月（七）

結(jié)果判斷，實(shí)驗(yàn)是否成功的要素在對(duì)照實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行判斷結(jié)合抗體和患者的資料熟悉病理基本知識(shí)和病變特點(diǎn)真陽性與假陽性真陰性與假陰性第26頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月判斷結(jié)果的基本原則陽性細(xì)胞定位是否明確，是胞膜、胞漿還是胞核陽性染色強(qiáng)度如何間質(zhì)清晰，無背景著色。陽性細(xì)胞要在5%以上，才能定為陽性。參考評(píng)價(jià)：

<5%-5%-25%+25%-50%++>50%+++

第27頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月（八）

完整的IHC實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱抗體名稱、來源、亞型、克隆號(hào)檢測(cè)的組織或細(xì)胞名稱、來源、組織種屬抗體的稀釋度（