《微生物學(xué)檢驗》細(xì)菌對抗菌藥物敏感性與耐藥性-課件

微生物學(xué)檢驗1ppt課件第六章細(xì)菌對抗菌藥物敏感性與耐藥性2ppt課件本章內(nèi)容第一節(jié)臨床常用抗菌藥物1第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗2第三節(jié)分枝桿菌的藥物敏感試驗3第四節(jié)細(xì)菌的耐藥性檢查43ppt課件學(xué)習(xí)目標(biāo)學(xué)習(xí)目標(biāo)：1．掌握抗菌藥物敏感試驗常用方法，紙片擴散法（K-B法）的操作方法、結(jié)果判斷及實驗質(zhì)量影響因素2．熟悉耐藥表型檢測；β-內(nèi)酰胺酶檢測方法；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）檢測方法3．了解臨床常用抗菌藥物種類；藥敏試驗中藥物選擇原則本章重點：★紙片擴散法（K-B法）的操作方法及結(jié)果判斷

★藥敏試驗的臨床意義4ppt課件第一節(jié)臨床常用抗菌藥物一、抗菌藥物分類1.β-內(nèi)酰胺類：抑制轉(zhuǎn)糖基酶、轉(zhuǎn)肽酶、D-羧肽酶、內(nèi)肽酶，從而細(xì)菌細(xì)胞壁合成。2.氨基糖苷類：抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成。

3.喹諾酮類：作用于DNA旋轉(zhuǎn)酶，干擾細(xì)菌DNA復(fù)制、修復(fù)和重組。4.大環(huán)內(nèi)酯類：結(jié)合細(xì)菌核糖體50S大亞基，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成和肽鏈延伸。5.糖肽類：阻斷肽聚糖合成，阻阻礙細(xì)胞壁合成。5ppt課件第一節(jié)臨床常用抗菌藥物一、抗菌藥物分類6.磺胺類：競爭性與二氫葉酸合成酶結(jié)合，使核酸合成抑制。7.四環(huán)素類：結(jié)合細(xì)菌30S核糖體亞基，抑制蛋白質(zhì)合成。8.氯霉素類：作用細(xì)菌70S核糖體的50S亞基，抑制蛋白合成。9.林可酰胺類：結(jié)合細(xì)菌核糖體50S大亞基，抑制蛋白質(zhì)合。10.其他抗菌藥物：硝基膚喃類、硝基咪唑類、鏈陽霉素類、噁唑烷酮類等。6ppt課件二、常規(guī)藥敏試驗藥物選擇原則我國主要遵循美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）制定的抗菌藥物選擇原則。第一節(jié)臨床常用抗菌藥物返回章內(nèi)容U組：僅用于治療泌尿道感染的藥物。C組：在A、B組藥物過敏或耐藥時選用；B組：只在A組藥物耐藥、過敏、無效時選擇性報告;A組：包括對特定菌群的常規(guī)試驗并常規(guī)報告的藥物；7ppt課件第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗一、概述測定抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑菌或殺菌作用的方法稱為抗菌藥物敏感試驗（AST）抗菌藥物敏感試驗方法紙片擴散法稀釋法E-test法8ppt課件

菌株被推薦劑量治療感染部位可達(dá)到的抗菌藥物濃度抑制藥物在生理濃集部位有臨床效果，還代表敏感與耐藥之間緩沖區(qū)

菌株不能被常規(guī)劑量抗菌藥物可到達(dá)的濃度所抑制敏感（S）耐藥（R）中介（I）抗菌藥物敏感試驗結(jié)果第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗9ppt課件二、紙片擴散法含有定量抗菌藥物紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含藥物吸收瓊脂中水分溶解后向紙片周圍區(qū)域擴散，形成遞減的梯度濃度。紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，形成透明抑菌圈。抑菌圈大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗10ppt課件二、紙片擴散法1.水解酪蛋白（MH）培養(yǎng)基，pH7.2～7.4，做成瓊脂厚度4mm，直徑90mm的平板2.挑取孵育16～24小時已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗11ppt課件二、紙片擴散法3.用無菌棉拭子蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液4.在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周5.平板在室溫下干燥3～5min，用無菌鑷子或紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣大于15mm第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗12ppt課件二、紙片擴散法6.平板置35±2℃孵育箱，16～18小時后判讀結(jié)果。苛養(yǎng)菌應(yīng)在含5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)20～24小時7.用游標(biāo)卡尺或直尺量取抑菌圈直徑。按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀，報告敏感、中介、耐藥第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗13ppt課件紙片擴散法圖解抑菌圈細(xì)菌生長藥敏紙片細(xì)菌菌落抗生素濃度耐藥敏感第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗14ppt課件三、稀釋法以一定濃度的抗菌藥物與培養(yǎng)基進(jìn)行一系列不同倍數(shù)稀釋，經(jīng)培養(yǎng)后觀察被試菌株的最低抑菌濃度，根據(jù)CLSI提供的MIC解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷細(xì)菌對抗菌藥物的敏感程度。稀釋法中使用肉湯培養(yǎng)基為肉湯稀釋法，使用瓊脂培養(yǎng)基為瓊脂稀釋法第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗15ppt課件三、稀釋法1.肉湯稀釋法濃度4

8 163264128256μg/ml混

清抗菌藥物素倍比稀釋，接種菌105CFU/ml，孵育溫度35℃，16～20h，判讀結(jié)果。第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗16ppt課件三、稀釋法2.瓊脂稀釋法

濃度16

3264128256

μg/ml制備含對倍抗生素濃度梯度的平板，制備菌懸液，點種菌，104/每點，孵育35℃，16～20h，判讀結(jié)果第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗17ppt課件四、E-test法E-test法（epsilometertest）結(jié)合了擴散法和稀釋法的原理和特點，對抗菌藥物直接測量MIC。E試條為寬5mm、長50mm的無孔試劑載體，一面固定有濃度呈連續(xù)指數(shù)增長的抗菌藥物，另一面有所含藥物濃度的刻度

細(xì)菌生長區(qū)Etest塑料條橢圓形細(xì)菌生長抑制區(qū)2561288016判讀抑菌濃度（MICug/ml)第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗18ppt課件四、E-test法1.菌液制備及接種均同紙片擴散法2.于90mm平板上可放E試驗試條1～2條，140mm平板最多可放6條3.孵育、溫度及時間同紙片擴散法4.讀取橢圓形抑菌環(huán)與E試條的交界點值即為MIC第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗19ppt課件五、質(zhì)量控制1.影響紙片擴散法的因素(1)培養(yǎng)基厚度(2)細(xì)菌濃度(3)抗菌藥物含量、擴散性(4)溫度，預(yù)孵育時間(5)判定標(biāo)準(zhǔn)(6)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗20ppt課件五、質(zhì)量控制2.質(zhì)量控制的要求（1）質(zhì)控菌：標(biāo)準(zhǔn)菌株來源國家微生物菌種保藏中心。標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)每周在MH瓊脂上傳代一次，4℃保存（2）質(zhì)控方法：在同一條件下，將新鮮傳代質(zhì)控菌株用與常規(guī)實驗相同的測定藥物進(jìn)行相同的操作方法后，測定質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)，以便對照監(jiān)測（3）抑菌圈質(zhì)控范圍：標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌圈應(yīng)落在規(guī)定范圍內(nèi)，范圍為95%的可信限返回章內(nèi)容第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗21ppt課件一、結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗指征首次從患者標(biāo)本分離的分枝桿菌需做藥敏試驗，有助于臨床合理用藥和監(jiān)測其藥物敏感性。經(jīng)過三個月正規(guī)抗結(jié)核治療，標(biāo)本中分枝桿菌分離培養(yǎng)仍為陽性的患者或重癥患者，以及來自高耐藥結(jié)核分枝桿菌流行區(qū)的患者，均須做體外藥敏試驗。

第三節(jié)

分枝桿菌的藥物敏感試驗22ppt課件二、體外藥敏試驗—絕對濃度法1.藥物溶液配制藥物先制成高濃度藥液，再按比例稀釋成低濃度藥液２.含藥培養(yǎng)基每100ml改良羅氏培養(yǎng)基加入1ml配制、稀釋好的抗結(jié)核藥液，無菌分裝7ml/管，85℃凝固。３.菌懸液培養(yǎng)物以0.5%吐溫-80生理鹽水稀釋，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁躈o.1比濁４.接種1mg/ml菌懸液10倍稀釋至10~2mg/ml，無菌吸取菌液0.1ml分別接種于含藥培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基斜面。37℃培養(yǎng)，四周觀察結(jié)果

第三節(jié)

分枝桿菌的藥物敏感試驗23ppt課件二、體外藥敏試驗—絕對濃度法５.結(jié)果報告按下列方式報告對照培養(yǎng)基及含藥培養(yǎng)基菌落情況：返回章內(nèi)容

第三節(jié)

分枝桿菌的藥物敏感試驗24ppt課件一、細(xì)菌耐藥性與耐藥機制1.產(chǎn)生一種或多種水解酶、鈍化酶和修飾酶2.抗菌藥物作用靶位改變，包括青霉素結(jié)合蛋白位點、DNA解旋酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的改變等3.抗菌藥物滲透障礙，包括細(xì)菌生物被膜形成和通道蛋白丟失4.藥物的主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)亢進(jìn)上述四種耐藥機制中，第一、二種耐藥機制具有專一性，第三、四種耐藥機制不具有專一性。

第四節(jié)細(xì)菌的耐藥性檢查25ppt課件二、耐藥表型檢測1.β-內(nèi)酰胺酶檢測（1）β-內(nèi)酰胺酶是一類水解青霉素、頭孢菌素類抗生素的滅活酶；該酶位于革蘭陽性球菌菌體外，革蘭陰性桿菌間質(zhì)中。（2）檢測方法有微生物培養(yǎng)法、碘－淀粉法、頭孢硝噻吩紙片法。其中頭孢硝噻吩紙片法因為簡單、方便、快速，應(yīng)用于臨床檢測。第四節(jié)細(xì)菌的耐藥性檢查26ppt課件二、耐藥表型檢測2．超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測

ESBL指由質(zhì)粒介導(dǎo)的能水解青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)內(nèi)酰胺類氨曲南的一類酶。

ESBLs不能水解頭霉素類和碳青霉烯類藥物，能被克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦等內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制。第四節(jié)細(xì)菌的耐藥性檢查27ppt課件二、耐藥表型檢測2.超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測（1）紙片擴散法表型初篩試驗出現(xiàn)以下一種情況即可懷疑菌株產(chǎn)生ESBL（篩選陽性）：頭孢泊肟≤17mm頭孢他啶≤22mm頭孢噻肟≤27mm頭孢曲松≤25mm氨曲南≤27mm第四節(jié)細(xì)菌的耐藥性檢查28ppt課件二、耐藥表型檢測2.超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測（紙片擴散法）（1）紙片擴散法表型確證試驗頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。任一復(fù)合藥物組的抑菌圈直徑與相應(yīng)單藥抑菌圈直徑相差≥5mm時，即可判斷該菌產(chǎn)ESBL

第四節(jié)細(xì)菌的耐藥性檢查29ppt課件二、耐藥表型檢測2.超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測（２）肉湯稀釋法表型初篩試驗出現(xiàn)以下一種情況即可懷疑該菌株產(chǎn)生ESBL：