凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白

凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白第1頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月背景層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography)。后來無色物質也可利用吸附柱層析分離。英國生物學家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論。1944年出現(xiàn)紙層析以后，層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)薄層層析、親和層析、凝膠層析、氣相層析、高壓液相層析等。第2頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月葉綠素通過碳酸鈣管柱所形成的色譜圖第3頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月層析的兩種相固定相：固定相是層析的一個基質。它可以是固體物質（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動相。在柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。層析法是利用混合物中各組分物理化學性質的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，即各組分所受的固定相的阻力和流動相的推力影響不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。第4頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月按層析過程的機理分類：分配層析:

根據(jù)不同組分在不同溶劑中分配系數(shù)不同而使物質分離的方法稱為分配層析。吸附層析:吸附是兩相成一界面，溶質在表面密集的現(xiàn)象。以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達到分離目的的一種層析技術稱為吸附層析。常用吸附劑：活性碳、硅。離子交換層析:

是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質酸堿度、極性和分子大小差異而將物質予以分離的一種方法。凝膠層析（分子篩）利用凝膠顆粒形成具有三維空間多孔性網(wǎng)絡結構的物質，不帶電荷，可起濾過或“篩”的作用。親和層析是利用生物分子間所具有的專一性親和力的層析技術。層析法分類第5頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月層析法分類按兩相所處的狀態(tài)分類：流動相有兩種狀態(tài)：液體作為流動相氣體作為流動相固定相也有兩種狀態(tài)：固體吸附劑作為固定相以吸附在固體上的液體作為固定相按兩相所處的狀態(tài)分為：液相層析和氣相層析流動相固定相液體（液相層析)氣體（固相層析）液體液-液層析氣-液層析固體液-固層析氣-固層析第6頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月層析法分類名稱操作形式適用范圍柱層析將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離的目的。柱層析是常用的層析形式，適用于大量樣品分析、分離。生物化學中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。薄層層析將適當粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點樣后用流動相展開，使各組份分離。薄層層析主要適用于小分子物質的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用。按操作形式不同分類：第7頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月吸附層析原理：任何兩個相都可以形成表面，其中一個相的物質或溶解在其中的溶質在此表面密集現(xiàn)象稱為吸附，利用吸附劑對不同物質具有不同吸附力使混合物得到分的現(xiàn)象就叫吸附層析。凡能將其他物質聚集到自己表面的物質稱吸附劑，包括硅皮、氧化鋁、活性炭、淀粉、纖維素及陶土，而聚集于聚集于吸附劑表面的物質稱被吸附劑。吸附劑與被吸附劑之間的作用除了物理作用外，還有化學作用，如DNS-氨基酸雙向聚酰胺薄膜層析時中被分離的物質之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之間形成氫鍵。第8頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月分配層析技術（液-液層析法）原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動相）之間的分配系數(shù)的不同而達到分離各組分的目的。紙層析是最廣泛的一種分配層析。特點：液-液層析法適合于分離同系物或同分異構體第9頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月分配層析技術分配系數(shù)小的溶質在流動相中分配的數(shù)量多，移動快；分配系數(shù)大的溶質在固定相中分配的數(shù)量多，移動慢。因此可彼此分開。分配系數(shù)主要與下列因素有關：①被分離物質本身的性質；②固定相和流動相的性質；③層析柱的溫度。相關的概念（一）：分配系數(shù)：當一種溶質分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在固定相和流動相兩相內(nèi)的濃度之比是個常數(shù)，稱為分配系數(shù)(Kd)。分配系數(shù)是層析中分離純化物質的主要依據(jù)Kd=Cs/Cm

其中Cs:固定相中的濃度，Cm:流動相中的濃度第10頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月分配層析技術相關的概念（二）：遷移率：在一定條件下，在相同的時間內(nèi)某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。常用Rf來表示。物質在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，Rf值也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來鑒定被分離的物質。Rf=色斑中心至原點中心的距離溶劑前緣至原點中心的距離第11頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月親和層析法親和層析（AffinityChromatography）是利用生物分子間專一性親和力而進行分離的一種層析技術。如我們熟悉的：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補的DNA等。親和層析的分離原理簡單的說就是通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行分離純化。親和層析可用于純化生物大分子、稀釋液的濃縮、不穩(wěn)定蛋白質的貯藏、從純化的分子中出去殘余的污染物、用免疫吸附劑吸附純化對此尚無互補配體的生物大分子，分離核酸是親和層析應用的重要方面。親和層析純化過程簡單、迅速，且分離效率高。對分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質尤為有效。缺點是針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件限制了其使用。第12頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月親和層析示意圖第13頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月離子交換層析離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同而進行分離純化。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質通過一定的化學反應共價結合上某種電荷基團形成的。離子交換劑包括交換樹脂和交換纖維素兩種。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質、電荷基團和平衡離子。電荷基團與高分子聚合物共價結合，形成一個帶電的可進行離子交換的基團。平衡離子是結合于電荷基團上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團發(fā)生可逆的交換反應。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團發(fā)生交換作用，稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負電的離子交換劑與帶負電的離子基團發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。第14頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠層析技術概念：凝膠層析又稱分子篩層析、排阻層析，當生物大分子隨流動相通過裝有作為固定相的凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進行分離的技術。原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔性網(wǎng)狀結構，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。第15頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠層析的原理分子大小不同混合物上柱；洗脫開始，小分子擴散進人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；大小分子分開：大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進行中。第16頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠顆粒是一類具有三維空間多孔性網(wǎng)絡結構的物質，不帶電荷，可起濾過或“篩”的作用。第17頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠層析的基本概念外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動相的體積。內(nèi)水體積是指凝膠顆粒中孔穴的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內(nèi)水體積?；|體積是指凝膠顆粒實際骨架體積。柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。我們設柱床體積為Vt，外水體積為Vo，內(nèi)水體積為Vi，基質體積為Vg，則有：

Vt＝Vo＋Vi＋Vg

由于Vg相對很小，可以忽略不計，則有：

Vt＝Vo＋Vi第18頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠層析柱各種體積示意圖（陰影部分）外水體積（V0）內(nèi)水體積（Vi）基質體積（Vg）柱床體積（Vt）第19頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月當分子的Kd＝0時，Ve＝Vo即該分子被完全排阻于凝膠顆粒之外，全部分布于流動相里，固定相里分布為零（A)；當分子的Kd＝1時，Ve＝Vo+Vi即該分子完全不被排阻，均勻的分布在流動相和固定相里，兩相比值為1(C)；當0<Kd<1時，Ve=Vo+Kd*Vi即表明分子受到部分排阻(B)。樣品的量洗脫體積第20頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗原理由于Hb（紅色，分子量64500）與二硝苯-魚精蛋白（黃色，分子量2000-12000）的分子量不同，通過交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50（sephadex）層析柱用蒸餾水洗脫分離。從顏色不同可直接觀察到血紅蛋白洗脫較快，魚精蛋白洗脫較慢。凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白第21頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月G類葡聚糖凝膠（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一種以右旋葡萄糖為殘基的多糖，分子間主要是α-1,6-糖苷鍵（約占95%），分枝為l,3-糖苷鍵（約占5%），以1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑將鏈狀結構連接為三維空間的網(wǎng)狀結構的高分子化合物。第22頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月葡聚糖凝膠網(wǎng)孔大小可通過調節(jié)交聯(lián)劑和葡聚糖的配比及反應條件來控制。交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，吸水膨脹就越小。交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，吸水膨脹就越大。G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表特水量。X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子質量生化產(chǎn)品。X數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品。X數(shù)字也代表凝膠的持水量，如G-25表示1g干膠持水2.5ml，G-100表示1g干膠持水10ml，依次類推。第23頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月裝柱前準備:先用自來水洗凈,再用蒸餾水洗凈,之后往層析柱加入2-3ml蒸餾水,以確保凝膠底部沒有氣泡；裝柱：垂直裝柱，待凝膠裝至柱高的10-15cm即可（裝柱的時候注意要不斷混勻凝膠）。注意防止氣泡與分層,否則重新裝柱。可用玻棒攪拌使表面平