胰島素的體外表達(dá)

生物化學(xué)實驗胰島素蛋白質(zhì)的體外表達(dá)指導(dǎo)老師：班級：生物技術(shù)（2）成員：曾祥玉劉偉江胰島素蛋白質(zhì)的表達(dá)一實驗原理利用基因工程技術(shù)及PCR技術(shù)，將胰島素基因片段獲取并插入質(zhì)粒中，篩選得到帶目的基因片段的質(zhì)粒，注入微生物大腸桿菌中復(fù)制，將復(fù)制的質(zhì)粒通過受體細(xì)胞表達(dá)出目的基因的蛋白質(zhì)——胰島素。二實驗?zāi)康牧私饣蚬こ痰幕静僮骷皯?yīng)用。三實驗器材PCR儀器，4種核苷酸，大腸桿菌，受體細(xì)胞，質(zhì)粒，逆轉(zhuǎn)錄酶，限制性內(nèi)切酶，連接酶，小白鼠，注射器等，中間幾步中所需器材及試劑省略。四實驗步驟（1）查找mRNA:通過網(wǎng)路查找到胰島素的mRNA，如下是胰島素的mRNA的有效序列：atggataatctgtcatcagaagaaattcaacagagagctcaccagattactgatgagtctctggaaagtacgaggagaatcctgggtttagccattgagtctcaggatgcaggaatcaagaccatcactatgctggatgaacaaaaggaacaactaaaccgcatagaagaaggcttggaccaaataaataaggacatgagagagacagagaagactttaacagaactcaacaaatgctgtggcctttgtgtctgcccatgtaatagcataactaatgatgccagagaagatgaaatggaagagaacctgactcaagtgggcagtatcctgggaaatctaaaagacatggccctgaacataggcaatgagattgatgctcaaaatccacaaataaaacgaatcacagacaaggctgacaccaacagagatcgtattgatattgccaatgccagagcaaagaaactcattgacagctaa（2） 目的基因的獲得：在胰腺中的胰島素B細(xì)胞獲得胰島素的mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄過程，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下獲得cDNA片段，再運用PCR擴增技術(shù)將目的基因擴增，篩選出有用的目的基因。（3） 質(zhì)粒和受體細(xì)胞的挑選：質(zhì)粒挑選，由于胰島素表達(dá)后需要進行修飾才具有活性，我們需要選擇真核表達(dá)載體。受體細(xì)胞挑選，質(zhì)粒的選擇和受體細(xì)胞應(yīng)相對應(yīng)，原核質(zhì)粒對應(yīng)原核受體，真核質(zhì)粒對應(yīng)真核受體，則應(yīng)選擇與質(zhì)粒相對應(yīng)的真核受體。（4） 目的基因插入表達(dá)載體：將目的基因與表達(dá)在同種限制性內(nèi)切酶的作用下處理，處理后并用連接酶將目的基因與載體相連接。由于連接是隨機性的，情況多樣，需要將插入了目的基因的載體挑選出來。（5） 目的基因的復(fù)制和擴增：將帶有目的基因的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，利用載體的抗性，進行有效的篩選并培養(yǎng)將目的基因復(fù)制。（6） 提取質(zhì)粒載體并檢測：通過堿裂解法將含目的基因的質(zhì)粒提取出來。堿裂解法師利用在NaOH和SDS溶液的作用下將大腸桿菌裂解，并將蛋白質(zhì)和DNA變性，而質(zhì)粒DNA能快速復(fù)性，將其分離的方法。將提取出來的質(zhì)粒DNA通過瓊脂糖凝膠電泳下跑膠，在紫外燈觀察DNA的存在。（7） 目的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞及培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞制作，將受體細(xì)胞在CaCl2的處理下使細(xì)胞膜的通透性增加，通過熱激處理讓DNA進入受體細(xì)胞，通過抗性培養(yǎng)基篩選出帶目的基因的細(xì)胞并培養(yǎng)，同時取出少量化平板保存。（8） 胰島素蛋白質(zhì)的獲取及活性檢測：經(jīng)上步培養(yǎng)后的細(xì)胞，將能把目的基因表達(dá)成蛋白質(zhì)，且由于是真核細(xì)胞做受體，產(chǎn)生的目的蛋白是分泌蛋白，直接通過離心取上清也即可獲得目的蛋白質(zhì).目的蛋白活性的檢測，胰島素是一種降血糖的激素，是由胰腺中的胰島B細(xì)胞產(chǎn)生的，在高血糖是，胰島素將增加。當(dāng)血糖較低是機體點出現(xiàn)休克狀況，利用此原理檢測胰島素活性。取三只生理發(fā)育狀況良好的小白鼠，將小白鼠的胰腺除去，分別標(biāo)記為一二三號，一號小白鼠注射生理鹽水，二號注射提取出來的胰島素蛋白質(zhì)，三號注射具有活性的胰島素，將三只小白鼠放入相同條件下，