脂質(zhì)體電動色譜用于評價藥物透皮吸收

史上最快最全的網(wǎng)絡文檔批量下載批量上傳，盡在：http:〃item.taobao?com/item?htm?id=9176907081史上最快最全的網(wǎng)絡文檔批量下載批量上傳，盡在：http:〃item.taobao?com/item.htm?id=9176907081脂質(zhì)體電動色譜用于評價藥物透皮吸收王永軍，劉洪卓，孫進，孫英華，劉曉紅，何仲貴※(沈陽藥科大學藥學院生物藥劑學研究室，遼寧沈陽，110016)摘要：目的采用脂質(zhì)體電動色譜法對藥物透皮吸收進行評估。方法測定22個不同種類化合物的保留因子(化)，采用逐步回歸法在藥物透皮參數(shù)(logKp)和logk及其它簡單理化參數(shù)之間建立定量保留活性關系(quantitativeretention-activityrelationships,QRARs)。結果建立了藥物透皮參數(shù)(logKp)和logk、分子量、化合物OH、NH鍵數(shù)目之和之間的相關方程，相關系數(shù)R2=0.902。結論脂質(zhì)體電動色譜在預測藥物透皮系數(shù)方面展現(xiàn)了良好的應用前景。關鍵詞：脂質(zhì)體；電動色譜；透皮參數(shù)；逐步回歸PredictingskinpermeabilityusingliposomeelectrokineticchromatogrpphyYongjunWang,HongzhuoLiu,JinSun,YinghuaSun,XiaohongLiu,ZhongguiHeABSTRACT:OBJECTIVEToestimatedrugpenetrationthroughskinusingliposomeelectrokineticchromatography.METHODSTheretentionfactoroftwenty-twostructurediverselycompoundsweredetermined,quantitativeretention-activityrelationshipswereconstructedbetweenskinpermeationcoefficientsandlogkandotherphysicochemicalparametersbystepwiseregressionmethod.RESULTSaquantitativeretention-activityrelationships(QRARs)wasconstructedbetweencompoundskinpermeabilitycoefficient(logKp)andlogk,molecularweight,thecountsofOHandNHofmoleculebystepwiseregressionmethod(R2=0.902).CONCLUSIONSInaword,LEKCisapromisingrapidtooltopredictdrugpenetrationthroughskin.課題獲國家自然科學基金No.30400563和遼寧省自然科學基金No.20052058資助。作者簡介：王永軍，男，沈陽藥科大學藥劑系講師，博士。email：i_maple@163.com※通訊作者：何仲貴，男，沈陽藥科大學藥劑系教授。Tel:(024)23986320，email:hezhonggui@KEYWORDSliposome;electrokineticchromatography;skinpermeationcoefficients;stepwiseregression借助毛細管電泳儀，把脂質(zhì)體溶液加入到毛細管中作為運行溶液，脂質(zhì)體作為一種假固定相(pseudostationary)，加壓運行后，測試溶質(zhì)依靠其自身的電泳屬性以及分配進入脂質(zhì)體程度的不同而分離，稱之為脂質(zhì)體電動色譜(liposomeelectrokineticchromatography,LEKC)。LEKC作為一種定量分析技術，不具有什么特別的優(yōu)勢，但由于脂質(zhì)體的組成、結構及性質(zhì)與生物膜的相似性，脂質(zhì)體作為一種類生物膜，用于研究藥物與生物膜的相互作用時有其獨特的優(yōu)勢。目前對于LEKC的研究報道主要集中在基礎研究方面，包括脂質(zhì)體在毛細管電泳中的遷移機制U-3】，LEKC中藥物與脂質(zhì)體的作用機制等方面［4-刀，應用研究報道較少［8-9］。當前，藥物化學高速發(fā)展，化合物數(shù)目急劇增加，同時中藥中蘊含數(shù)目龐大的天然化合物，這些都使得適宜體內(nèi)藥動學特征的藥物篩選成為新藥開發(fā)的瓶頸，脂質(zhì)體同天然生物膜結構上的相似性與毛細管電泳的快速高效性相結合，為突破這一瓶頸提供了強有力的工具。皮膚由表皮、真皮和皮下組織三部分組成，此外還有汗腺、皮脂腺、毛囊等附屬器。表皮由內(nèi)向外可分為五層，即基層、棘層、粒層、透明層和角質(zhì)層，其中表皮中的角質(zhì)層性質(zhì)與其它各層有較大差異，是藥物透皮吸收的主要屏障。角質(zhì)層主要由角蛋白和脂類成分組成，這些脂類成分包括磷脂、鞘磷脂、膽固醇和一些脂肪酸。角質(zhì)層中不存在主動轉運的活性蛋白，完全是一個被動轉運的屏障。因此，我們有理由認為藥物的透皮吸收與其親脂性密切相關。本文收集了22個有皮膚滲透系數(shù)(logKp)的化合物，擬在藥物在LEKC上的保留因子和透皮參數(shù)之間建立一種定量保留一活性關系，用于預測未知化合物的透皮吸收，初步考察它們與透皮參數(shù)的相似性。1實驗條件1.1試藥、試劑及儀器試藥：苯、間苯二酚、氫化可的松、酮洛芬、雙氯芬酸等為沈陽藥科大學藥劑、藥分教研室提供。試劑：蛋黃磷脂(磷脂酰膽堿含量＞97.5%，PC)，購自上海東尚實業(yè)有限公司；大豆磷脂酰絲氨酸(磷脂酰絲氨酸＞91.9%，PS)，氫化磷脂(HPC)，膽固醇(Chol)，購自北京百威昂醫(yī)藥技術開發(fā)有限公司； Polybrene(PB)、dextransulfate(DS)(MWav=500000)、壬基苯酮，購自Aldrich-Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)購自，二甲基亞颯(DMSO)、甲醇等均為分析純試劑。儀器：JY92-2D超聲波細胞粉碎機(寧波新芝科器研究所)；LS230型激光衍射粒徑分析儀(貝克曼一庫爾特公司)；HPCE-10毛細管電泳儀(大連江申分離科學技術公司)。1.2電泳條件熔融石英毛細管(河北永年銳灃色譜器件有限公司)，總長43cm，進樣端距檢測窗38cm，內(nèi)徑50pm；溫度：室溫；電壓：+10?20kV；檢測波長210nmo全新熔融石英毛細管的預處理：1MNaOH溶液沖洗30min；0.1MNaOH溶液沖洗10min；重蒸水沖洗20min。涂層毛細管的制備：將全新熔融石英毛細管預處理后，以5%PB溶液沖洗15min，靜置10min；以3%DS溶液沖洗15min，靜置30min，重蒸水沖洗10min備用。1.3脂質(zhì)體的制備稱取適量磷脂至250mL圓底燒瓶中，加入氯仿一甲醇(9:1，V/V)10mL溶解；60^水浴減壓蒸餾30min除去有機溶劑；將預熱至60°C的20mM的pH5.5磷酸鹽緩沖溶液加入燒瓶中，水化分散；探頭超聲20min，參數(shù)設置為超聲3s，間歇2s,功率200W；然后經(jīng)0.22-urn微孔濾膜過濾，充氮氣4。。條件下冷藏備用。1.4溶質(zhì)在LEKC上保留因子的計算usk= (Eq.(1)(te()(1-「))lipk=(。一頊 Eq.(2)t(t(1-廣))lip公式1、2分別為中性和荷電溶質(zhì)保留因子的計算公式，tr、yt如分別為溶質(zhì)在LEKC上的出峰時間、電滲流出峰時間(甲醇、二甲基亞颯等標記)、脂質(zhì)體出峰時間(壬基苯酮等標記)，t0為帶電溶質(zhì)在CZE下的運行時間。2結果與討論2.1定量保留-活性關系的建立為建立一種定量保留一活性關系，用于預測未知化合物的透皮吸收，收集了22個有皮膚滲透系數(shù)(logKp)的化合物，分別采用含有膽固醇脂質(zhì)體和不含有膽固醇脂質(zhì)體測定其LEKC保留因子，結果見表1。表1Tab.1對logkChol或logk與logKp之間進行相關性研究，沒有發(fā)現(xiàn)它們之間有顯著的相關性。Lien等人曾報道如下的logKp預測模型，見Eq.(4-2)[⑶。logKp=kJogP+k2MW+k3Hb+k4 Eq.(3)logP為正辛醇/水分配系數(shù)，MW為分子量，Hb指代的是化合物氫鍵的數(shù)目，k「k2、k3為回歸系數(shù)，k4為回歸常數(shù)。為建立化合物LEKC保留因子與logKp之間的預測模型，我們引入了MW/100、OsNs、OHsNHs、PSA等理化參數(shù)，以逐步回歸方法剔除不顯著的參數(shù)，最后引入的參數(shù)中只保留了MW/100和OHsNHs，回歸結果見下：

0.20(0.18)0.10(0.19)0.37(0.31)logKp=0.42(0.13)logkChol-0.92(0.09)看-0.37(0.08)OHsNHs+0.20(0.18)0.10(0.19)0.37(0.31)Eq.(4)R2=0.935,SE=0.379,n=22MW]"p=0.44(0」7岫-0.89。10)100-0.40(0.09)朋用+Eq.(5)R2=0.923,SE=0.410,n=22為與正辛醇/水系統(tǒng)作以比較，同樣進行回歸處理，結果如下：、 ……MW 岫=0.19(0E"-爵7"而-0.26(0.13)OHsNHs-Eq.(6)R2=0.911,SE=0.441,n=22從上述等式看，以含有膽固醇脂質(zhì)體的LEKC建立了最好的相關模型，即Eq.⑷，因為Eq.⑷有著最高的相關系數(shù)(R2=0.935)和最小的均方根誤差(SE=0.379)；而以正辛醇/水系統(tǒng)建立的模型相對較差，因為Eq.(6)有著最大的均方根誤差(SE=0.441)和最低的相關系數(shù)(R2=0.911)。從等式的系數(shù)看，log*、logP與logKp正相關，而MW/100、OHsNHs與logKp負相關。因為log*、log尸是化合物的親脂性參數(shù)，這也正說明了化合物的親脂性增加更有利于其滲透進入皮膚，而親水性的化合物則不易滲透進入；MW/100代表的是分子體積，描述的是分子體積對其從水相分配進入生物膜及通過生物膜擴散的影響；OHsNHs指代的是化合物分子的氫鍵供體數(shù)目，與logKp的負相關說明化合物分子氫鍵供體數(shù)目增加不利于其滲透進入皮膚。2.2模型驗證由于所收集的化合物數(shù)目較少，只有22個，不足以分為測試集和驗證集對相關模型進行驗證，所以我們采用了leave-one-out的方法進行模型驗證。所謂leave-one-out模型驗證就是在總的數(shù)據(jù)(n)中去掉一個數(shù)據(jù)，用余下的數(shù)據(jù)(n-1)建立模型來預測去掉的這個數(shù)據(jù)，如此類推，經(jīng)過n次迭代計算，即可獲得n個預測數(shù)據(jù)，將原試驗值與測試值進行相關比較來考察所建立模型的預測能力。采用該方法分別對Eq.(4)、Eq.(5)、Eq.(6)進行模型驗證，各預測值見表2,相關散點圖見圖1、2、3。表2Tab.2圖1Fig!圖2Figi圖3Figi從圖1、2、3可看出，基于LEKC建立的Eq.(4)預測的logKp值與試驗值有最好的相關性(R2=0.934)，而基于正辛醇/水系統(tǒng)建立的Eq.⑹的預測能力相對較差(R2=0.911)。這是由于脂質(zhì)體與正辛醇/水系統(tǒng)的本質(zhì)差別造成的，log尸描述的僅是化合物分子形態(tài)在兩相中的分配，而化合物的解離狀態(tài)強烈影響其在皮膚中的滲透性。2.3與文獻模型的比較把文獻報道的皮膚滲透模型與我們建立的模型加以比較，總結見表3。Flnn等［14］最先報道了logKp與log尸之間的相關性，R2=0.26，所測試的化合物有90種，分子量從18?750，log尸從-3?6；Potts等［14］在Flnn研究的基礎上，引入了分子量，并減少了化合物數(shù)量至42種，R2=0.82；Lien等［15］又在Potts的基礎上引入氫鍵項Hb，進一步減少測試化合物至23種，R2=0.93；Barbato等［16］用IAM考察了10種藥物的親脂性，經(jīng)過考察發(fā)現(xiàn)除疏水作用力外其它作用力強度的總和(AIq^am)與logKp呈負相關，R2=0.91；Medina-Hernandez等［17］用BMC測定化合物親脂性，在引入熔點項的基礎上，測試了43種化合物，R2=0.79。各個預測模型所測試的化合物數(shù)目種類不一樣，無法進行直接比較。但從相關系數(shù)看，我們所建立的模型給出了最好的結果，并且所測試的化合物性質(zhì)、結構更多樣，更具代表性，另外LEKC技術的高通量篩選優(yōu)勢也是上述模型所無法比擬的。表3Tab.33結論測定了22個化合物pH5.5條件下的LEKC保留因子，采用逐步回歸的方法，引入其它理化參數(shù)，建立了藥物透皮參數(shù)logKp與log*、MW/100、OHsNHs之間的預測模型。結果表明含有膽固醇脂質(zhì)體所建立的模型比沒有膽固醇脂質(zhì)體所建立的模型，相關系數(shù)更高、方程均方根誤差更低。采用leave-one-out方法對模型進行了驗證，結果也表明了較之正辛醇/水系統(tǒng)，脂質(zhì)體在本質(zhì)上更為接近于生物膜。與文獻報道的其它預測模型相比較，本研究所測試的化合物性質(zhì)、結構更多樣，模型更具代表性，LEKC技術也更具高通量篩選優(yōu)勢。參考文獻WiedmerSK,HolopainenJM,MustakangasP,etal,Liposomeascarriersinelectrokineticcapillarychromatography[J],Electrophoresis,2000,21:3191-3198WiedmerSK,HautalaJ,HolopainenJM,etal,Studyonliposomesbycapillaryelectrophoresis[J],Electrophoresis,2001,22:1305-1313WiedmerSK,JussilaM,HolopainenJM,etal,Cholesterol-containingphosphatidylcholineliposomes:characterizationanduseasdispersedphaseinelectrokineticcapillarychromatography[J],JSepSci,2002,25:427-437BurnsST,KhalediMG,Rapiddeterminationofliposome-waterpartitioncoefficientusingliposomeelectrokineticchromatography[J],JPharmSci,2002,91:1601-1612BurnsST,AgbodjanAA,KhalediMG,Characterizationofsalvationpropertiesoflipidbilayermembranesinliposomeelectrokineticchromatography[J],JChromatogrA,2002,973:167-176CarrozzinoJM,KhalediMG,Interactionofbasicdrugswithlipidbilayersusingliposomeelectrokineticchromatography[J],PharmRes,2004,21:2327-2335CarrozzinoJM,KhalediMG,pHeffectsondruginteractionswithlipidbilayersbyliposomeelectrokineticchromatography[J],JChromatogrA,2005,1079:307-316OrnskovE,GottfriesJ,EricksonM,etal,Experimentalmodelingofdrugmembranepermeabilitybycapillaryelectrophoresisusingliposomes,micellesandmicroemulsions[J],JPharmPharma,2005,57:435-442PascoeRJ,MasucciJA,FoleyJP,Investigationofvesicleelectrokineticchromatographyasaninvitroassayfortheestimationofintestinalpermeabilityofpharmaceuticaldrugcandidates[J],Electrophoresis,2006,27:793-804Burns,S.T.,Khaledi,M.G.,Rapiddeterminationofliposomewaterpartition...usingliposomeelectrokineticchromatography[J],J.Pharm.Sci.2002,91,1601-1612ViethM,SiegelMG,HiggsRE,etal,Characteristicphysicalpropertiesandstructuralfragmentsofmarketedoraldrugs[J],JMedChem,2004,47:224-232NeumannD,KohlbacherO,MerkwirthC,etal,Afullycomputationalmodelforpredictingpercutaneousdrugabsorption[J],JChemInfModel,2006,46:424-429LienEJ,GaoH,QSARanalysisofskinpermeabilityofvariousdrugsinmanascomparedtoinvivoandinvitrostudiesinRodents[J],PharmRes,1995,12:583-587FlynnGL,Physicochemicaldeterminantsofskinabsorption,InPrinciplesofRoute-to-RouteExtrapolationforRiskAssessment[M],EditedbyGarrityTRandHenryCJ,Elsevier:NewYork,1990:93-127RenS,DasA,LienEJ,QSARanalysisofmembranepermeabilityotorganiccompounds[J],JDrugTarget,1996,4:103-107BarbatoF,CappelloB,MiroA,etal,Chromatographicindexesonimmobilizedartificialmembranesforthepredictionoftransdermaltransportofdrugs[J],Farmaco,1998,53:655-661Martinez-PlaJJ,Martin-BioscaY,SagradoS,etal,Biopartitioningmicellarchromatographytopredictskinpermeability[J],BiomedChrom,2003,17:530-537

表1滲透系數(shù)的試驗值以及各種試驗和計算的理化參數(shù)Table.1Experimentalpermeabilitycoefficientsandexperimentalandcalculated

physicochemicalparameters.CompoundsExperimentallog^Chola)logkb)MW/100c)OHsNHsd)logKp(cm/h)[12]logPAmobarbital-2.642.11-0.69-0.642.262.00Aniline-1.660.84-1.37-1.040.932.00Phenol-1.901.46-1.16-0.640.941.00Anisole-1.602.11-0.35-0.111.080.00Benzylalcohol-1.771.10-1.27-0.451.081.00Ibuprofen-1.443.660.00Indomethacin-3.673.08-1.05-0.993.580.00Ranitidine-4.050.63-1.13-0.763.143.00Hydrocortisone-4.721.43-0.36-0.124.332.00Famotidine-4.79-0.575.00Chlorphenamine-2.665.800.620.622.751.004-Chlorophenol-1.482.40-0.49-0.201.291.004-Bromophenol-1.442.531.004-Methylphenol-1.821.97-0.50-0.101.081.00Ethylbenzene0.083.170.620.601.060.00Toluene0.002.64-0.02-0.020.920.00Benzaidehyde-0.851.48-0.88-0.791.060.002-Naphthol-1.552.840.800.801.441.00Phenobarbital-3.351.24-0.83-0.542.262.00Ephedrine-2.220.89-0.72-0.331.652.00Piroxicam-3.810.80-1.10-0.723.312.00Benzene-0.962.14-0.16-0.160.780.00Chromatographicconditions:9mMPC80PS20-6mMcholesterolliposomesin10mMpH5.5phosphatebuffer,appliedvoltage,+20kVChromatographicconditions:9mMPC80PS20liposomesin10mMpH5.5phosphatebuffer,appliedvoltage,+20kV.Molecularweightwasdividedby100toscaleitwithLEKCretentionfactors.OHsNHs,thecountsofOHsandNHs,approximatelyrepresentinghydrogen-bonddonord11】.表2采用Eq.(4)、Eq.(5)、Eq.(6)計算的預測值及試驗值Table.2ExperimentalandpredictedpermeabilitycoefficientsdeterminedusingEq.(4),(5)and(6).CompoundsExperimentallog阡(cm/h)PredictedlogKpEq.⑷Predictedlog阡Eq.⑸PredictedlogKpEq.(6)Amobarbital-2.64-2.08-2.09-1.75Aniline-1.66-1.08-1.00-0.65Phenol-1.90-0.67-0.50-0.31Anisole-1.60-0.10-0.01-0.06Benzylalcohol-1.77-0.84-0.56-0.51Ibuprofen-1.44-0.80-0.76-0.73Indomethacin-3.67-2.56-2.47-2.20Ranitidine-4.05-3.40-3.28-3.10Hydrocortisone-4.72-3.76-3.61-3.77Famotidine-4.79-3.69-3.74-3.12Chlorphenamine-2.66-1.56-1.52-1.074-Chlorophenol-1.48-0.74-0.65-0.504-Bromophenol-1.44-0.86-0.87-0.904-Methylphenol-1.82-0.55-0.41-0.37Ethylbenzene0.080.360.360.18Toluene0.008Benzaidehyde-0.85-0.29-0.26-0.102-Naphthol-1.55-0.28-0.27-0.26Phenobarbital-3.35-2.14-2.05-1.71Ephedrine-2.22-1.53-1.41-1.37Piroxicam-3.81-3.18-3.03-2.96Benzene-0.960.260.240.34