topo克隆和點(diǎn)突變課件

TOPO克隆技術(shù)與基因定點(diǎn)突變技術(shù)北京全式金生物技術(shù)有限公司TOPO克隆技術(shù)與基因定點(diǎn)突變技術(shù)1背景資料基因克隆是分子生物學(xué)必不可少的工具，傳統(tǒng)的T4DNALigase方法實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。TOPO克隆——5分鐘快速克隆，是克隆技術(shù)的革命。這個(gè)技術(shù)上的飛躍為實(shí)現(xiàn)“加速科研”的理念提供了先決條件。基因定點(diǎn)突變技術(shù)——改造基因的便利方法?；蚬δ苎芯恳呀?jīng)成為生命科學(xué)研究的新熱點(diǎn)，因此需要強(qiáng)有力的工具保證基因結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系研究的進(jìn)行。背景資料基因克隆是分子生物學(xué)必不可少的工具，傳統(tǒng)的T4DN2TOPO克隆技術(shù)TOPO克隆原理TOPO克隆策略TOPO克隆成功的關(guān)鍵TOPO克隆常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法TOPO克隆技術(shù)TOPO克隆原理3TOPO克隆原理TOPO即Topoisomerase拓?fù)洚悩?gòu)酶特點(diǎn)：由316個(gè)氨基酸組成識(shí)別5’-CCCTT-3’同時(shí)具有限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶的功能不需要能量TOPO克隆原理TOPO即Topoisomerase拓?fù)洚?TOPO克隆——原理TOPO克隆——原理5TOPO克隆——過(guò)程TOPO克隆——過(guò)程6TOPO克隆——過(guò)程TOPO克隆迅速、便捷載體片段產(chǎn)物5minTOPO克隆——過(guò)程TOPO克隆迅速、便捷載體片段產(chǎn)物7TOPO克隆——克隆策略有無(wú)雜帶？有無(wú)引物二聚體？PCR產(chǎn)物無(wú)雜帶，有引物二聚體均有或有雜帶均無(wú)GelExtractionKitPCRPurificationKit基因克隆、轉(zhuǎn)化TOPO克隆——克隆策略有無(wú)雜帶？有無(wú)引物二聚體？PCR產(chǎn)物8TOPO克隆和傳統(tǒng)T4克隆比較Topo克隆T4DNALigase克隆PCR產(chǎn)物無(wú)需純化可直接用于克隆（若無(wú)雜帶和引物二聚體）需要純化，否則抑制連接反應(yīng)時(shí)間5分鐘過(guò)夜（12小時(shí)）操作載體+片段（污染幾率?。┹d體+片段+T4DNALigaseBuffer+T4DNALigase（污染幾率大）克隆效率>85%～60%特點(diǎn)省時(shí)（至少節(jié)約1天）快速、高效費(fèi)時(shí)TOPO克隆和傳統(tǒng)T4克隆比較Topo克隆T4DNALi9TransGenTOPOVectorpEASY-T1CloningVetorpEASY-T1SimpleCloningVetorpEASY-T3CloningVetorpEASY-BluntCloningVetorpEASY-BluntSimpleCloningVetorpEASY-E1ExpressionVetorpEASY-E2ExpressionVetorTransGenTOPOVectorpEASY-T1C10克隆載體圖譜[TACloning]克隆載體圖譜[TACloning]11克隆載體圖譜[BluntCloning]克隆載體圖譜[BluntCloning]12表達(dá)載體[TACloning]一步法載體構(gòu)建——藉由TOPO技術(shù)實(shí)現(xiàn)!表達(dá)載體[TACloning]一步法載體構(gòu)建——藉由TOP13TOPO克隆成功的關(guān)鍵引物設(shè)計(jì)PCR條件克隆反應(yīng)設(shè)置（DNA加入量、反應(yīng)的溫度和時(shí)間）克隆感受態(tài)細(xì)胞的選擇選用質(zhì)量好的膠回收或PCR純化試劑盒TOPO克隆成功的關(guān)鍵引物設(shè)計(jì)14引物設(shè)計(jì)：

?引物不能磷酸化；

?引物5’端第一個(gè)堿基會(huì)影響下游的連接效率；PCR注意事項(xiàng)：

?后延伸設(shè)置為72℃10～20分鐘；

目的：保證擴(kuò)增片段完整，可以有效降低擴(kuò)增背景；使用Taq系列DNA聚合酶擴(kuò)增時(shí)，該步驟相當(dāng)于加A反應(yīng)。

引物設(shè)計(jì)：15目的片段加入量[為保證良好的連接效率，推薦如下]?700bp以及更小的片段：保證20ng?700bp以上的片段：保證30~100ng?2Kbp左右的片段：保證40ng?3Kbp左右的片段：保證60ng?片段加入量max：4μl，濃度很低時(shí)也有一定的連接效率，體積大于5μl會(huì)破壞反應(yīng)體系平衡；?片段加入量min：0.5μl，濃度很高時(shí)需要稀釋?zhuān)梢匝a(bǔ)充無(wú)菌水方便操作。反應(yīng)溫度：TOPO酶的工作溫度為20℃～37℃目的片段加入量[為保證良好的連接效率，推薦如下]16反應(yīng)時(shí)間：PCR產(chǎn)物/PCR純化產(chǎn)物25℃5min膠回收產(chǎn)物/加A產(chǎn)物25℃10min25℃10～15min25℃15min【大片段、特殊結(jié)構(gòu)】25℃20min【大片段、特殊結(jié)構(gòu)】反應(yīng)時(shí)間：PCR產(chǎn)物/PCR純化產(chǎn)物25℃5min膠回17克隆感受態(tài)細(xì)胞的選擇：Top10適用于毒基因的克隆DH5α普遍使用JM109同源重組率低，提取質(zhì)粒質(zhì)量最好XL1-Blue適合非甲基化DNA的轉(zhuǎn)化（必要時(shí)可以代替DMT）Mach1-T1具有T1、T5噬菌體抗性，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度快OmniMAX2-T1具有T1、T5噬菌體抗性，可用于文庫(kù)構(gòu)建TL-Blue適用于大質(zhì)粒DNA和重組產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化降低片段大小的偏愛(ài)性，可用于文庫(kù)構(gòu)建克隆感受態(tài)細(xì)胞的選擇：Top10適用于毒基因的克隆DH5α普18選擇質(zhì)量好的膠回收或PCR純化試劑盒：試劑品質(zhì)很關(guān)鍵質(zhì)量不好的試劑盒很可能會(huì)抑制下游連接選擇質(zhì)量好的膠回收或PCR純化試劑盒：19TOPO克隆常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法克隆數(shù)少（確認(rèn)感受態(tài)細(xì)胞效率正常時(shí)）克隆陽(yáng)性率低PCR鑒定重組子失敗菌落多為淡藍(lán)色或FishEye（白邊藍(lán)芯）TOPO克隆常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法克隆數(shù)少（確認(rèn)感受態(tài)細(xì)胞效率正20反應(yīng)時(shí)間產(chǎn)物不新鮮１．克隆數(shù)少或陽(yáng)性率低：膠回收片段DNA濃度低毒基因基因特殊結(jié)構(gòu)反應(yīng)時(shí)間產(chǎn)物不新鮮１．克隆數(shù)少或陽(yáng)性率低：膠回收片段DNA濃21上述五種情況，均需要適當(dāng)延長(zhǎng)連接反應(yīng)時(shí)間！以保證連接效率和克隆數(shù)。（可參考上文的載體連接反應(yīng)時(shí)間）另外每種情況也有一些特別的地方可以改進(jìn)，進(jìn)一步提高克隆效果。上述五種情況，均需要適當(dāng)延長(zhǎng)連接反應(yīng)時(shí)間！以保證連接效率和克22PCR產(chǎn)物不新鮮：Why~3’端熱力學(xué)不穩(wěn)定，3’－“A”容易脫落直接導(dǎo)致TA克隆效率低How~PCR產(chǎn)物置于4℃保存1～2天內(nèi)使用不要冷凍PCR產(chǎn)物PCR結(jié)束后立即使用效果最好PCR產(chǎn)物不新鮮：23克隆膠回收片段：Why~紫外照射和EB對(duì)dsDNA造成損傷；(受到損傷的DNA不是連接的最佳底物)

3’-“A”容易在電泳過(guò)程中被核酸外切酶降解，導(dǎo)致TA連接效率低；試劑殘留的抑制。How~操作中通過(guò)細(xì)節(jié)注意避免克隆膠回收片段：24目的片段濃度很低：Why~無(wú)法保證有效碰撞How~濃縮DNA目的片段濃度很低：25毒基因：Why~其本底表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主生長(zhǎng)有明顯抑制How~選用Top10毒基因：26基因特殊結(jié)構(gòu)：Why~具有高AT、高GC、反向重復(fù)序列的基因，不容易連接How~調(diào)整、摸索連接體系和條件嘗試不同的載體，不同的骨架對(duì)片段偏好性不同基因特殊結(jié)構(gòu)：27２．PCR鑒定重組子失?。含F(xiàn)象：用通用引物鑒定時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物既無(wú)目的帶又無(wú)載體自連帶How~預(yù)變性95℃10min（徹底裂解菌體、釋放DNA）最好能用通用引物鑒定所謂連接失敗實(shí)為誤判?。玻甈CR鑒定重組子失?。核^連接失敗實(shí)為誤判！28３．菌落多為淡藍(lán)色或FishEye：Why~插入片段沒(méi)有影響LacZ基因讀碼框插入片段?。ㄐ∮?00bp）How~不要丟棄平板！進(jìn)行進(jìn)一步鑒定所謂連接失敗實(shí)為誤判?。常涠酁榈{(lán)色或FishEye：所謂連接失敗實(shí)為誤判！29基因定點(diǎn)突變技術(shù)利用PCR實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變的幾種傳統(tǒng)方法GeneTailor，QuickChange，Easy/FastMutagenesisSystem

三種市售點(diǎn)突變?cè)噭┖械谋容^基因定點(diǎn)突變技術(shù)利用PCR實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變的幾種傳統(tǒng)方法30傳統(tǒng)方法：僅利用PCR反向PCR定點(diǎn)突變重疊延伸PCR定點(diǎn)突變大引物PCR定點(diǎn)突變傳統(tǒng)方法：僅利用PCR反向PCR定點(diǎn)突變31反向PCR：特點(diǎn)：必須以質(zhì)粒為模板；引物方向相反；引物需要磷酸化。反向PCR：32重疊延伸PCR：特點(diǎn)：兩輪PCR重疊延伸PCR：33大引物PCR：特點(diǎn)：兩輪PCR大引物PCR：34GeneTailor，QuickChange，Easy/FastMutagenesisSystem也是基于PCR原理實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變，但它們與傳統(tǒng)方法的區(qū)別主要在于可以對(duì)突變克隆進(jìn)行初步的篩選篩選原理：降解甲基化質(zhì)粒模板篩選依據(jù)：來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒99%發(fā)生甲基化；

PCR是去甲基化過(guò)程，PCR產(chǎn)物（發(fā)生突變的產(chǎn)物）是去甲基化的產(chǎn)物。GeneTailor，QuickChange，Easy/Fa35篩選方法：?體內(nèi)降解：原始質(zhì)粒模板可以被能降解甲基化質(zhì)粒的大腸桿菌（DMT）降解，而去甲基化的擴(kuò)增產(chǎn)物（發(fā)生突變的產(chǎn)物）不會(huì)被降解。?體外降解：DpnI識(shí)別序列5’-GmATC-3’（在DNA序列中，一般每256bp中出現(xiàn)一次）。甲基化模板可被DpnI識(shí)別、切割，而去甲基化的擴(kuò)增產(chǎn)物（發(fā)生突變的產(chǎn)物）不會(huì)被降解。篩選方法：36Invitrogen：

GeneTailorMutagenesisSystem優(yōu)點(diǎn)?引物部分重疊，指數(shù)擴(kuò)增?擴(kuò)增產(chǎn)物可見(jiàn)，易于操作?篩選方法：DMT體內(nèi)降解缺點(diǎn)：?突變點(diǎn)在一條引物上?無(wú)DpnI限制性?xún)?nèi)切酶降解模板Invitrogen：

GeneTailorMutagen37Stratagene：

QuickChangeMutagenesisSystem優(yōu)點(diǎn)：?篩選方法：DpnI限制性?xún)?nèi)切酶缺點(diǎn)：?引物完全重疊，線性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物不可見(jiàn)，可操作性差?擴(kuò)增產(chǎn)物為線狀?無(wú)DMT體內(nèi)消化降解模板Stratagene：

QuickChangeMutage38TransGen:

Easy/FastMutagenesisSystem共有部分：PCR組分、DpnI酶、DMT細(xì)胞EasyMutagenesisSystem：使用EasyPfu酶FastMutagenesisSystem：使用FastPfu酶——

擴(kuò)增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高，擴(kuò)增10Kb左右的質(zhì)粒只需2個(gè)小時(shí)?。ㄕ?qǐng)參考《金品是怎樣煉成的》）TransGen:

Easy/FastMutagenesi39TransGen：?引物部分重疊，指數(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可見(jiàn)，易于操作；擴(kuò)增產(chǎn)物為環(huán)狀；?兩條引物上均有突變點(diǎn)，突變效率高；?DpnI體外降解篩選+DMT體內(nèi)降解篩選=雙重篩選！大大提高陽(yáng)性率。TransGen：?引物部分重疊，指數(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可見(jiàn)，易40TransGen：Easy/FastMutagenesisSystem

引物設(shè)計(jì)示意圖正向引物上的突變點(diǎn)反向引物上的突變點(diǎn)FWD5’5’REV3’3’重疊區(qū)延伸區(qū)TransGen：Easy/FastMutagenesis41引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增特點(diǎn)模板降解方法Invitroge