topo克隆和點突變課件

TOPO克隆技術與基因定點突變技術北京全式金生物技術有限公司TOPO克隆技術與基因定點突變技術1背景資料基因克隆是分子生物學必不可少的工具，傳統(tǒng)的T4DNALigase方法實驗周期長。TOPO克隆——5分鐘快速克隆，是克隆技術的革命。這個技術上的飛躍為實現(xiàn)“加速科研”的理念提供了先決條件?；蚨c突變技術——改造基因的便利方法?；蚬δ苎芯恳呀洺蔀樯茖W研究的新熱點，因此需要強有力的工具保證基因結構和功能關系研究的進行。背景資料基因克隆是分子生物學必不可少的工具，傳統(tǒng)的T4DN2TOPO克隆技術TOPO克隆原理TOPO克隆策略TOPO克隆成功的關鍵TOPO克隆常見問題及解決方法TOPO克隆技術TOPO克隆原理3TOPO克隆原理TOPO即Topoisomerase拓撲異構酶特點：由316個氨基酸組成識別5’-CCCTT-3’同時具有限制性內切酶和連接酶的功能不需要能量TOPO克隆原理TOPO即Topoisomerase拓撲異4TOPO克隆——原理TOPO克隆——原理5TOPO克隆——過程TOPO克隆——過程6TOPO克隆——過程TOPO克隆迅速、便捷載體片段產物5minTOPO克隆——過程TOPO克隆迅速、便捷載體片段產物7TOPO克隆——克隆策略有無雜帶？有無引物二聚體？PCR產物無雜帶，有引物二聚體均有或有雜帶均無GelExtractionKitPCRPurificationKit基因克隆、轉化TOPO克隆——克隆策略有無雜帶？有無引物二聚體？PCR產物8TOPO克隆和傳統(tǒng)T4克隆比較Topo克隆T4DNALigase克隆PCR產物無需純化可直接用于克隆（若無雜帶和引物二聚體）需要純化，否則抑制連接反應時間5分鐘過夜（12小時）操作載體+片段（污染幾率?。┹d體+片段+T4DNALigaseBuffer+T4DNALigase（污染幾率大）克隆效率>85%～60%特點省時（至少節(jié)約1天）快速、高效費時TOPO克隆和傳統(tǒng)T4克隆比較Topo克隆T4DNALi9TransGenTOPOVectorpEASY-T1CloningVetorpEASY-T1SimpleCloningVetorpEASY-T3CloningVetorpEASY-BluntCloningVetorpEASY-BluntSimpleCloningVetorpEASY-E1ExpressionVetorpEASY-E2ExpressionVetorTransGenTOPOVectorpEASY-T1C10克隆載體圖譜[TACloning]克隆載體圖譜[TACloning]11克隆載體圖譜[BluntCloning]克隆載體圖譜[BluntCloning]12表達載體[TACloning]一步法載體構建——藉由TOPO技術實現(xiàn)!表達載體[TACloning]一步法載體構建——藉由TOP13TOPO克隆成功的關鍵引物設計PCR條件克隆反應設置（DNA加入量、反應的溫度和時間）克隆感受態(tài)細胞的選擇選用質量好的膠回收或PCR純化試劑盒TOPO克隆成功的關鍵引物設計14引物設計：

?引物不能磷酸化；

?引物5’端第一個堿基會影響下游的連接效率；PCR注意事項：

?后延伸設置為72℃10～20分鐘；

目的：保證擴增片段完整，可以有效降低擴增背景；使用Taq系列DNA聚合酶擴增時，該步驟相當于加A反應。

引物設計：15目的片段加入量[為保證良好的連接效率，推薦如下]?700bp以及更小的片段：保證20ng?700bp以上的片段：保證30~100ng?2Kbp左右的片段：保證40ng?3Kbp左右的片段：保證60ng?片段加入量max：4μl，濃度很低時也有一定的連接效率，體積大于5μl會破壞反應體系平衡；?片段加入量min：0.5μl，濃度很高時需要稀釋，可以補充無菌水方便操作。反應溫度：TOPO酶的工作溫度為20℃～37℃目的片段加入量[為保證良好的連接效率，推薦如下]16反應時間：PCR產物/PCR純化產物25℃5min膠回收產物/加A產物25℃10min25℃10～15min25℃15min【大片段、特殊結構】25℃20min【大片段、特殊結構】反應時間：PCR產物/PCR純化產物25℃5min膠回17克隆感受態(tài)細胞的選擇：Top10適用于毒基因的克隆DH5α普遍使用JM109同源重組率低，提取質粒質量最好XL1-Blue適合非甲基化DNA的轉化（必要時可以代替DMT）Mach1-T1具有T1、T5噬菌體抗性，在液體培養(yǎng)基中生長速度快OmniMAX2-T1具有T1、T5噬菌體抗性，可用于文庫構建TL-Blue適用于大質粒DNA和重組產物的轉化降低片段大小的偏愛性，可用于文庫構建克隆感受態(tài)細胞的選擇：Top10適用于毒基因的克隆DH5α普18選擇質量好的膠回收或PCR純化試劑盒：試劑品質很關鍵質量不好的試劑盒很可能會抑制下游連接選擇質量好的膠回收或PCR純化試劑盒：19TOPO克隆常見問題及解決方法克隆數(shù)少（確認感受態(tài)細胞效率正常時）克隆陽性率低PCR鑒定重組子失敗菌落多為淡藍色或FishEye（白邊藍芯）TOPO克隆常見問題及解決方法克隆數(shù)少（確認感受態(tài)細胞效率正20反應時間產物不新鮮１．克隆數(shù)少或陽性率低：膠回收片段DNA濃度低毒基因基因特殊結構反應時間產物不新鮮１．克隆數(shù)少或陽性率低：膠回收片段DNA濃21上述五種情況，均需要適當延長連接反應時間！以保證連接效率和克隆數(shù)。（可參考上文的載體連接反應時間）另外每種情況也有一些特別的地方可以改進，進一步提高克隆效果。上述五種情況，均需要適當延長連接反應時間！以保證連接效率和克22PCR產物不新鮮：Why~3’端熱力學不穩(wěn)定，3’－“A”容易脫落直接導致TA克隆效率低How~PCR產物置于4℃保存1～2天內使用不要冷凍PCR產物PCR結束后立即使用效果最好PCR產物不新鮮：23克隆膠回收片段：Why~紫外照射和EB對dsDNA造成損傷；(受到損傷的DNA不是連接的最佳底物)

3’-“A”容易在電泳過程中被核酸外切酶降解，導致TA連接效率低；試劑殘留的抑制。How~操作中通過細節(jié)注意避免克隆膠回收片段：24目的片段濃度很低：Why~無法保證有效碰撞How~濃縮DNA目的片段濃度很低：25毒基因：Why~其本底表達產物對宿主生長有明顯抑制How~選用Top10毒基因：26基因特殊結構：Why~具有高AT、高GC、反向重復序列的基因，不容易連接How~調整、摸索連接體系和條件嘗試不同的載體，不同的骨架對片段偏好性不同基因特殊結構：27２．PCR鑒定重組子失敗：現(xiàn)象：用通用引物鑒定時，擴增產物既無目的帶又無載體自連帶How~預變性95℃10min（徹底裂解菌體、釋放DNA）最好能用通用引物鑒定所謂連接失敗實為誤判?。玻甈CR鑒定重組子失敗：所謂連接失敗實為誤判！28３．菌落多為淡藍色或FishEye：Why~插入片段沒有影響LacZ基因讀碼框插入片段?。ㄐ∮?00bp）How~不要丟棄平板！進行進一步鑒定所謂連接失敗實為誤判?。常涠酁榈{色或FishEye：所謂連接失敗實為誤判！29基因定點突變技術利用PCR實現(xiàn)點突變的幾種傳統(tǒng)方法GeneTailor，QuickChange，Easy/FastMutagenesisSystem

三種市售點突變試劑盒的比較基因定點突變技術利用PCR實現(xiàn)點突變的幾種傳統(tǒng)方法30傳統(tǒng)方法：僅利用PCR反向PCR定點突變重疊延伸PCR定點突變大引物PCR定點突變傳統(tǒng)方法：僅利用PCR反向PCR定點突變31反向PCR：特點：必須以質粒為模板；引物方向相反；引物需要磷酸化。反向PCR：32重疊延伸PCR：特點：兩輪PCR重疊延伸PCR：33大引物PCR：特點：兩輪PCR大引物PCR：34GeneTailor，QuickChange，Easy/FastMutagenesisSystem也是基于PCR原理實現(xiàn)點突變，但它們與傳統(tǒng)方法的區(qū)別主要在于可以對突變克隆進行初步的篩選篩選原理：降解甲基化質粒模板篩選依據：來自大腸桿菌的質粒99%發(fā)生甲基化；

PCR是去甲基化過程，PCR產物（發(fā)生突變的產物）是去甲基化的產物。GeneTailor，QuickChange，Easy/Fa35篩選方法：?體內降解：原始質粒模板可以被能降解甲基化質粒的大腸桿菌（DMT）降解，而去甲基化的擴增產物（發(fā)生突變的產物）不會被降解。?體外降解：DpnI識別序列5’-GmATC-3’（在DNA序列中，一般每256bp中出現(xiàn)一次）。甲基化模板可被DpnI識別、切割，而去甲基化的擴增產物（發(fā)生突變的產物）不會被降解。篩選方法：36Invitrogen：

GeneTailorMutagenesisSystem優(yōu)點?引物部分重疊，指數(shù)擴增?擴增產物可見，易于操作?篩選方法：DMT體內降解缺點：?突變點在一條引物上?無DpnI限制性內切酶降解模板Invitrogen：

GeneTailorMutagen37Stratagene：

QuickChangeMutagenesisSystem優(yōu)點：?篩選方法：DpnI限制性內切酶缺點：?引物完全重疊，線性擴增，擴增產物不可見，可操作性差?擴增產物為線狀?無DMT體內消化降解模板Stratagene：

QuickChangeMutage38TransGen:

Easy/FastMutagenesisSystem共有部分：PCR組分、DpnI酶、DMT細胞EasyMutagenesisSystem：使用EasyPfu酶FastMutagenesisSystem：使用FastPfu酶——

擴增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高，擴增10Kb左右的質粒只需2個小時?。ㄕ垍⒖肌督鹌肥窃鯓訜挸傻摹罚㏕ransGen:

Easy/FastMutagenesi39TransGen：?引物部分重疊，指數(shù)擴增，擴增產物可見，易于操作；擴增產物為環(huán)狀；?兩條引物上均有突變點，突變效率高；?DpnI體外降解篩選+DMT體內降解篩選=雙重篩選！大大提高陽性率。TransGen：?引物部分重疊，指數(shù)擴增，擴增產物可見，易40TransGen：Easy/FastMutagenesisSystem

引物設計示意圖正向引物上的突變點反向引物上的突變點FWD5’5’REV3’3’重疊區(qū)延伸區(qū)TransGen：Easy/FastMutagenesis41引物設計擴增特點模板降解方法Invitroge