新生兒疾病篩查技術(shù)

新生兒疾病篩查中心

新生兒疾病篩查技術(shù)進展北京婦幼保健院北京新生兒疾病篩查中心新生兒疾病篩查中心新生兒疾病篩查的意義

新生兒疾病篩查是指醫(yī)療保健機構(gòu)在新生兒群體中，用快速簡便敏感的檢驗方法，對一些危及兒童生命、危害兒童生長發(fā)育、導(dǎo)致兒童智能障礙的先天性疾病遺傳代謝性疾病進行群體篩查，從而使患者在臨床上未出現(xiàn)疾病表現(xiàn)，而其體內(nèi)生化、激素水平已有明顯變化時就做出早期診斷，及時有效地進行治療，從而保證兒童正常的智能發(fā)育和體格發(fā)育新生兒疾病篩查中心篩查疾病的選擇標準：

疾病危害嚴重，可導(dǎo)致殘疾或致死。

疾病早期無特殊癥狀，但有實驗室指標顯示陽性。

有可靠的、適合大規(guī)模進行的篩查方法篩查的疾病可以治療。特別是通過早期治療能逆轉(zhuǎn)或減慢疾病發(fā)展篩查費用低廉，成本效益較好新生兒疾病篩查中心新生兒疾病篩查的歷史：新生兒疾病篩查概念的形成細菌抑制法的建立CH篩查方法的建立臍帶血測定TSH新生兒末梢血T4測定干血濾紙片測定TSH

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“新生兒疾病篩查”概念的形成：

1934年挪威生化學(xué)家Folling首次報道PKU。1953年德國Bickel醫(yī)生使用飲食療法治療PKU獲得成功，并同時提出早診斷、早治療的想法，設(shè)想盡早將患兒從正常人群中篩選出來?！靶律鷥杭膊『Y查”概念由此形成。新生兒疾病篩查中心新生兒疾病篩查在國外的研究情況

目前世界上已經(jīng)有很多國家開展了新篩工作。對新篩的研究十分活躍，從1966年首屆新生兒疾病篩查的國際會議在南斯拉夫召開，到現(xiàn)在已經(jīng)召開了10余屆。1993年在日本召開了第一屆亞太地區(qū)新篩會議，今年9月在上海將召開第五屆亞太地區(qū)新篩會議。新生兒疾病篩查中心新生兒疾病篩查的進展

篩篩查查疾技病術(shù)增改加進新生兒疾病篩查中心

篩查的疾病

1982年，在日本東京召開的第二屆國際新生兒疾病篩查大會上提出了適合大規(guī)模篩查的四種疾病：PKU、CH、Gal、CAH。隨著對遺傳代謝病的深入了解和新的篩查技術(shù)的應(yīng)用，又有一些疾病被列入篩查范圍，如葡萄糖6磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥、生物素酶缺乏（BDD）、酪氨酸血癥、鐮狀紅細胞貧血（SCD）、His、MSUD、HC、囊性纖維化（CF）等疾病。應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜可篩查包括氨基酸代謝異常、有機酸代謝異常和脂肪酸代謝異常約30種疾病。新生兒疾病篩查中心

篩查方法的改進：

半定量分析、定量分析放免方法、酶免疫方法、熒光免疫方法、時間分辨熒光免疫分析法、串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)、基因芯片技術(shù)等。篩查技術(shù)的重大突破是從“一種實驗檢測一種疾病”發(fā)展到“一種實驗檢測多種疾病”。

新生兒疾病篩查中心新生兒疾病篩查的現(xiàn)狀

目前，全世界每年有數(shù)千萬新生兒進行篩查，一些國家已經(jīng)將新生兒疾病篩查列入國家衛(wèi)生法，或者采用行政手段，使活產(chǎn)新生兒的篩查覆蓋率接近100%。美國每年有400萬嬰兒接受新生兒疾病篩查。新生兒疾病篩查中心世界部分國家開展的新生兒篩查項目國家PKUCHGalCHACFBDDMSUDSCDHS其他

USA▲▲▲▲▲▲▲▲▲

日本▲▲▲▲▲▲新西蘭▲▲▲▲▲▲▲意大利▲▲▲▲▲▲▲巴西▲▲▲▲▲▲▲▲▲

阿根廷▲▲▲▲▲▲▲奧地利▲▲▲▲▲▲▲

德國▲▲▲▲▲▲▲▲▲比利時▲▲▲▲▲▲▲▲英國▲▲▲法國▲▲▲丹麥▲▲▲瑞士▲▲▲▲▲

新生兒疾病篩查中心部分亞洲國家開展的新篩項目國家或地區(qū)篩查疾病開始時間

中國PKU、CH、G6PD#、CAH#

1981中國臺灣PKU、CH、CAH、Gal、G6PD、HC、（MS/MS）1981中國香港CH、G6PD1984日本PKU、CH、CAH、Gal、MSUD、HC、（MS/MS）70年代初韓國PKU、CH、MSUD、Gal、His、HC、（MS/MS）1991菲律賓CH、PKU、CAH、G6PD1996泰國CH、PKU1996新加坡CH、G6PD1965越南CH1998蒙古CH2000

新生兒疾病篩查中心中國新生兒疾病篩查的狀況

我國的新生兒疾病篩查開始于80年代，1994年頒布的《中華人民共和國母嬰保健法》第24條明確提出要“逐步開展新生兒疾病篩查、嬰兒多發(fā)病和常見病防治等醫(yī)療保健服務(wù)”，將新生兒疾病篩查第一次寫入母嬰保健法。新生兒疾病篩查這項工作得到了政府的重視，2001年6月20日國務(wù)院公布了《中華人民共和國母嬰保健法實施辦法》，新生兒疾病篩查的推廣和提高是其中的重要內(nèi)容。新生兒疾病篩查中心

截止到1998年，我國已經(jīng)在16個省建立了18個新生兒疾病篩查中心。大多數(shù)篩查中心篩查的疾病是PKU和CH，無錫、上海和南京增加了先天性腎上腺皮質(zhì)增生的篩查。其中上海篩查了50600個新生兒，篩出3例21羥化酶缺乏的患者，發(fā)病率為1：16866。廣東、廣西增加了葡萄糖6磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥的篩查。G6PD是一種紅細胞酶的缺陷病，在廣東、廣西、云南、四川發(fā)病率較高，據(jù)統(tǒng)計廣州的發(fā)病率是3.6%，湛江地區(qū)發(fā)病率為4.6%。

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為保證新篩工作能夠高質(zhì)量順利的完成，以下三個方面是必不可少的：1。強大健全的篩查網(wǎng)絡(luò)2。嚴格準確的篩查實驗3。及時追蹤、治療、隨訪患者新生兒疾病篩查中心強大健全的篩查網(wǎng)絡(luò)

新生兒疾病篩查屬于預(yù)防醫(yī)學(xué)的范疇旨在早期確認患某種特定遺傳代謝性疾病的患兒，它是遺傳學(xué)實驗滲入到預(yù)防醫(yī)學(xué)的標志。新生兒疾病篩查必須在各級衛(wèi)生行政部門的支持領(lǐng)導(dǎo)下納入預(yù)防醫(yī)學(xué)發(fā)展規(guī)劃中，制定相關(guān)的政策、法規(guī)，建立良好的篩查管理網(wǎng)絡(luò)，強化機構(gòu)、人員許可制度，才能保證標本及時地采集、遞送、隨訪，并建立有效的監(jiān)督評價機制。利用各種衛(wèi)生宣傳活動，孕婦學(xué)校，張貼宣傳新篩意義的相關(guān)資料，對孕婦、新生兒的父母、醫(yī)護人員進行宣傳教育，使之認識到新生兒疾病篩查的重要性和必要性。新生兒疾病篩查中心嚴格準確的篩查實驗

新生兒疾病篩查實驗絕非僅指新篩實驗室具體的標本測定過程，而是一個包括多個環(huán)節(jié)的全過程。新篩是在患者未出現(xiàn)癥狀之前，通過實驗檢查把患者篩選出來。因此，對疾病診斷的唯一依據(jù)就是實驗結(jié)果，這與通常進行的臨床檢驗項目意義顯然不同。篩查結(jié)果顯示陽性，就能把患兒篩選出來，如果實驗結(jié)果是假陰性，就會出現(xiàn)漏診。新生兒疾病篩查中心新生兒篩查的技術(shù)路線

標本的采集標本的運輸標本登記編號標本的分析結(jié)果分析

治療隨訪新生兒疾病篩查中心標本的采集1.手套和采血針的選擇:手套無滑石粉、每一個新生兒更換一個。采血針要能夠控制穿刺深度，<3mm2.采血人員的要求：經(jīng)過正規(guī)培訓(xùn)考核合格的固定人員，嚴格掌握采血時間、足跟部位、方法、合格血片的標準、正確填寫采血卡片的內(nèi)容，并要執(zhí)行簽名制度。采血的質(zhì)量直接影響到篩查實驗的正確性。3.采血卡片的填寫：4.采血登記：新生兒疾病篩查中心5.采集時間：對于苯丙酮尿癥，在無蛋白質(zhì)負荷或少蛋白質(zhì)負荷時，血中苯丙氨酸含量較低，實驗結(jié)果可能出現(xiàn)假陰性。生后72小時采血，既可以保證新生兒吃足母乳，又可以避過TSH生理性高峰期。6.標本保存和遞送：標本疊放時應(yīng)將血斑交替隔開放置，避免兩張卡片的血斑相互污染，冰箱放置，7天左右送到新篩中心。新生兒疾病篩查中心實驗室分析新生兒疾病篩查常用技術(shù)和方法

苯丙酮尿癥篩查方法

細菌抑制法

酶法

熒光分析法

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細菌抑制法（bacterialinhibitionassayBIA)

1961美國Guthrie醫(yī)生建立了細菌抑制法，是苯丙氨酸半定量測定法，具有靈敏、簡便、重復(fù)性好、經(jīng)濟、不需要特殊設(shè)備，適合于大規(guī)模群體篩查等優(yōu)點。19621963年，用此方法在美國進行了40萬新生兒篩查，發(fā)現(xiàn)患者20多人，并進行了早期治療。

新生兒疾病篩查中心實驗原理

枯草桿菌變異菌株(bacillussubtilisAATT6633)的生長需要苯丙氨酸存在。若在培養(yǎng)基中加入苯丙氨酸的抑制劑-2噻吩丙氨酸后，細菌的生長受到抑制，-2噻吩丙氨酸對枯草桿菌的生長抑制作用可因外界加入苯丙氨酸得到解除。所以在含有適當比例枯草桿菌和-2噻吩丙氨酸的培養(yǎng)平板上，將含有新生兒血滴的干血濾紙片放入培養(yǎng)板上，標本上的苯丙氨酸滲入周圍培養(yǎng)基中，經(jīng)過37℃孵育過夜，如果苯丙氨酸存在過量，新生兒疾病篩查中心由于其競爭抑制使細菌恢復(fù)了生長。細菌環(huán)直徑的大小與苯丙氨酸的濃度成正比。根據(jù)生長環(huán)直徑的大小與已知量的標準菌環(huán)直徑比較，即可得出樣品中苯丙氨酸的含量。

儀器和材料

儀器：3mm直徑打孔器、37℃恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺等新生兒疾病篩查中心材料：枯草桿菌ATCC6633芽孢懸液、

0.5mmol/L-2噻吩丙氨酸、苯丙氨酸標準濾紙片、

10xDemain’s營養(yǎng)液、青霉素酶

新生兒疾病篩查中心操作步驟培養(yǎng)板的制備：1.5g瓊脂加135ml蒸餾水，加熱溶解，自然冷卻至60~65℃后加入：

10xDemain’s營養(yǎng)液15ml

抑制劑1.5ml

枯草桿菌0.25ml青霉素酶0.15ml充分混勻到入培養(yǎng)板，備用。

新生兒疾病篩查中心加樣：用3mm直徑的打孔器打下標準血片、質(zhì)控血片和待測血標本，用鑷子將血片放在相應(yīng)的編號上。

孵育和觀察：將培養(yǎng)板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜，次日取出，量取標準和待測血標本細菌生長環(huán)直徑，通過標準曲線的回歸方程，計算標本中苯丙氨酸的含量。新生兒疾病篩查中心結(jié)果判斷：凡血苯丙氨酸濃度>切值的標本，均先進行原標本復(fù)查，再招回新生兒進一步取樣復(fù)查，進行苯丙氨酸定量分析，以便確診。新生兒疾病篩查中心熒光測定法熒光法是定量測定苯丙氨酸的一種方法。該方法靈敏度高，商品化試劑盒的檢測低限為0.5mg/dl。當血膽紅素<200mol/L時，對實驗結(jié)果無干擾。通過嚴格控制pH值可最大程度控制其他氨基酸的干擾。新生兒疾病篩查中心

實驗原理

苯丙氨酸與茚三酮反應(yīng)，形成熒光化合物，在反應(yīng)體系中加入二肽L-亮氨酸-L-丙氨酸可提高熒光反應(yīng)，用琥珀酸鹽緩沖液嚴格控制反應(yīng)條件，pH值在5.8±0.1可保證理想的熒光值和最大的特異性。加入銅試劑穩(wěn)定熒光復(fù)合物并終止反應(yīng)。

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儀器和材料儀器：熒光讀數(shù)儀自動洗扳機振蕩儀3mm打孔器加樣器新生兒疾病篩查中心材料：商品化試劑盒，包括茚三酮、L-亮氨酸-L-丙氨酸、琥珀酸鹽緩沖液、銅試劑、標準品、質(zhì)控品、酶標板等。新生兒疾病篩查中心操作步驟1.用3mm打孔器分別將標準品、質(zhì)控品、待測血標本打下，依次放入酶標板內(nèi)。2.每孔加入80l的80%乙醇，室溫振蕩30分鐘，900轉(zhuǎn)/分。3.轉(zhuǎn)移50l洗脫液至另一塊酶標板。4.加50l反應(yīng)混合液，振蕩1分鐘后，37℃溫育2小時。新生兒疾病篩查中心5.每孔加200l冷的銅試劑，冷卻反應(yīng)混合物至室溫。6.室溫放置15分鐘。7.加入銅試劑后15~30分鐘內(nèi)，在波長485nm處，測定每孔的熒光強度。結(jié)果判斷

可用電腦酶標工作軟件，自動繪制標準曲線，計算標本的苯丙氨酸濃度。新生兒疾病篩查中心干血濾紙片促甲狀腺激素的測定方法

酶免疫分析法熒光酶免疫分析法時間分辨熒光免疫分析法新生兒疾病篩查中心

酶免疫分析法

又稱為酶聯(lián)免疫吸附分析法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。酶免技術(shù)是以酶標記抗體或抗原作為主要試劑，與標本中待測的相應(yīng)抗原或抗體反應(yīng)后，通過標記物的放大作用，檢測出標本中的待測物質(zhì)。該方法的特點是具有高度的特異性和敏感性。新生兒甲低的篩查使用的是雙抗體夾心法測定干血濾紙片中的抗原h(huán)TSH濃度。新生兒疾病篩查中心原理

利用固相反應(yīng)板包被抗hTSH抗體，成為固相抗體反應(yīng)板，加入直徑3mm的被測定的干血濾紙片、標準干血濾紙片、質(zhì)控干血濾紙片和酶標記抗體液（辣根過氧化物酶，hTSH-HRP),通過一定時間的反應(yīng)，由于兩種單克隆抗體所抗hTSH相位上的不同，在反應(yīng)體系中，從干血濾紙片、標準干血濾紙片、質(zhì)控干血濾紙片中溶出的hTSH都能與固相抗體和酶標記抗體同時結(jié)合，形成雙抗體夾心抗原h(huán)TSH的復(fù)合物。待反應(yīng)穩(wěn)新生兒疾病篩查中心定后，濾紙片和血液中的其他成分以及游離的過量酶標記抗體經(jīng)洗滌而被去除，此時反應(yīng)體系中被測物質(zhì)的含量與酶成一定的比例關(guān)系，然后加入酶作用的底物，經(jīng)酶對底物一定時間的催化作用，使底物變成可測定的產(chǎn)物，最后通過酶標儀讀出產(chǎn)物的吸收值。此讀數(shù)的高低與被測物TSH的含量成正比。通過與在同等條件下測得的標準值比較由繪制的標準曲線計算出未知標本中hTSH的含量。新生兒疾病篩查中心試劑和材料1.試劑盒的組成：包被抗hTSH抗體的96孔固相反應(yīng)板、酶標記的抗hTSH抗體復(fù)合物、酶反應(yīng)底物（四甲基聯(lián)苯胺TMB）、顯色劑稀釋液、標準干血濾紙片1套、終止液等。2.儀器：酶標讀數(shù)儀（配備電腦）、振蕩儀、洗扳機、打孔器、自動多道可調(diào)移液器等。新生兒疾病篩查中心串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果分析遺傳代謝病是由于人體內(nèi)某些酶生物合成發(fā)生障礙，引起體內(nèi)毒性中間代謝產(chǎn)物積累或必需代謝物的缺乏，在血液中表現(xiàn)為相應(yīng)代謝物如氨基酸、乙酰肉堿的含量增高。串聯(lián)質(zhì)譜是通過計算離子率，即代謝物的豐度與相應(yīng)內(nèi)標豐度之比，然后在預(yù)先建立的標準曲線上將比率轉(zhuǎn)換成濃度，以診斷相應(yīng)的遺傳代謝缺陷病。新生兒疾病篩查中心串聯(lián)質(zhì)譜篩查的氨基酸代謝病（16種）苯丙酮尿癥（PKU）楓糖尿癥（MSUD）同型胱氨酸尿癥（homocystinuria)酪氨酸血癥I型、II型，暫時性酪氨酸血癥組氨酸血癥高甲硫氨酸血癥非酮性高血糖癥高脯氨酸血癥I型、II型高鳥氨酸血癥瓜氨酸血癥精氨琥珀酸尿癥精氨酸酶缺乏磷酸氨甲酰合成酶缺乏

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串聯(lián)質(zhì)譜篩查的有機酸代謝紊亂病（13種）

丙酸血癥異戊酸血癥戊二酸血癥I型、II型甲基丙二酸血癥甲基丙二酸輔酶-A變異酶缺乏癥

新生兒疾病篩查中心串聯(lián)質(zhì)譜篩查的脂肪酸氧化缺陷病（10種）

短鏈乙酰輔酶A脫氫酶缺乏癥中鏈乙酰輔酶A脫氫酶缺乏癥長鏈乙酰輔酶A脫氫酶缺乏癥極長鏈乙酰輔酶A脫氫酶缺乏癥長鏈羥化乙酰輔酶A脫氫酶缺乏癥肉堿棕櫚油酰合成酶缺乏癥肉堿棕櫚油酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥肉堿轉(zhuǎn)運體缺乏癥2,4二烯酰輔酶A還原酶缺乏癥肉堿/乙酰肉堿轉(zhuǎn)位酶缺乏癥新生兒疾病篩查