產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定

產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定

纖維是世界上豐富的可再生資源。利用纖維素類物質對解決全球能源危機具有重要意義。我國是個農業(yè)大國,秸稈總產(chǎn)量居世界首位,每年產(chǎn)生約8×10纖維素酶是由多種可降解纖維素生成葡萄糖的水解酶組成的復雜酶系,因此定義為纖維素酶系。根據(jù)纖維素酶組分在降解纖維素過程中作用的不同,將纖維素酶分為3類,分別為內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶目前,國內DNS測纖維素酶活法多使用分光光度計來測量吸光值,且反應體系都在試管中進行。測量過程步驟復雜,耗時時間長、粗酶液樣品需求量大,不利于大批量樣品快速檢測酶活。本實驗采用Kim近年來,離子束在改良生物材料方面的應用與發(fā)展十分迅速。離子束具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、誘變育種技術穩(wěn)定可靠、簡便易行、重復性好等優(yōu)點,且誘變效應是局部、可選擇、可控的1材料和方法1.1材料表面1.1.1樣品采集1.1.2培養(yǎng)基CMC-Na初篩培養(yǎng)基(g/L):CMC-Na10.0g/L,NaCl5.0g/L,KH1.1.3剛果紅試劑的制備3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS)配置方法:酒石酸鉀鈉182.0g,溶于500mL蒸餾水中,加熱(不超過50℃),于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3g、NaOH21.0g、苯酚5.0g、無水亞硫酸鈉5.0g,攪拌至完全溶解,冷卻后用蒸餾水定容至1000mL,貯于棕色瓶中,避光室溫保存兩周后使用剛果紅試劑:剛果紅1g/L。亞甲基藍染色劑:亞甲基藍1g/L。1.1.4壓力蒸汽滅菌鍋ZHP-230落地冷凍搖床:常州普天儀器制造公司;YXQ-LS-SOSII型立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;離心機Allegra1.2方法1.2.1cmc-na雙篩培養(yǎng)專菌落將收集到的土樣與無菌水充分混合,過濾去除殘渣。收集樣品過濾后的濾液,取適量濾液上清液進行梯度稀釋,將稀釋液涂在CMC-Na初篩培養(yǎng)基上,30℃恒溫培養(yǎng),出現(xiàn)菌落后反復劃線、純化培養(yǎng),獲得純菌落。1.2.2菌落直徑和透明圈直徑測定將純化后的菌落分別點種在CMC-Na初篩培養(yǎng)基上,每個培養(yǎng)基點3個樣,30℃培養(yǎng)3d,用1g/L剛果紅染液染色20min,棄去染液,加入1mol/LNaCl溶液,洗滌5min后棄去NaCl溶液,測量菌落直徑和透明圈直徑,分別用D和H來表示。根據(jù)透明水解圈直徑和菌落直徑的比值(D/H)大小初步判斷菌株產(chǎn)纖維素酶的能力,選取比值大的菌株進行后續(xù)研究。1.2.3srrna基因多態(tài)性pcr檢測將出發(fā)菌株進行分子鑒定,取搖瓶180r/min,培養(yǎng)3d的菌液離心,提取DNA。以所提取的DNA為模版,使用細菌的通用引物27F和1492R進行16SrRNA基因的PCR擴增。擴增體系為50μL(10×Buffer5.0μL,MgCl1.2.4菌體誘變致死率測定將出發(fā)菌株在CMC-Na生長培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2d。用接種環(huán)挑取適當菌體到4mL的誘變保護劑中,并用震蕩器使菌體在誘變保護劑中均勻分布制成菌懸液,然后測量菌懸液的OD誘變致死率公式:致死率=1-誘變后存活菌株數(shù)/原始菌株數(shù)正突變率公式:正突變率=發(fā)生正突變的菌株數(shù)/樣本菌株數(shù)1.2.6形態(tài)特征觀察用接種環(huán)點種出發(fā)菌株與突變菌株在CMC-Na生長培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)96h后,觀察單菌落形態(tài)特征。同時用亞甲基藍試劑對菌體進行染色,并在1000倍顯微鏡下進行鏡檢。1.2.7菌株的篩選和酶活測定初篩:輻照后的菌株在CMC-Na液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中37℃,160r/min搖床培養(yǎng)12h后,稀釋涂布于CMC-Na生長培養(yǎng)基上。30℃培養(yǎng)48h后,從平板上挑取單菌落進行編號,通過畫線擴大培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌株用無菌槍頭或牙簽接種至裝有2mLCMC-Na產(chǎn)酶培養(yǎng)基的試管中。放入37℃,180r/min的搖床中培養(yǎng)24h后,酶標儀測其酶活。復篩:將初篩CMC酶活較高的突變菌株挑出,傳代培養(yǎng)5代后。每個突變菌株以5%的接種量,在37℃,180r/min搖床培養(yǎng)24h后,測其CMC酶活。1.2.8羧甲基纖維素鈉溶液配制本實驗所測CMC酶活為內切葡聚糖酶活,CMC酶活測定采用酶標儀高通量測定法。測定樣品如圖1所示。取待測粗酶液20μL于96孔板中,加入20μL1%的羧甲基纖維素鈉溶液(pH為5.0的磷酸緩沖液配置)。40℃水浴反應30min,然后加人160μLDNS試劑,用鋁箔包好96孔板,防止揮發(fā),放入120℃的鼓風干燥箱中烘烤20min,然后用酶標儀在540nm波長下測定光吸收值,并從葡萄糖標準曲線上計算得出相對應的葡萄糖含量,進而計算酶活酶活力定義為:在適當?shù)臏囟群蚿H值條件下,每1min內1mL酶液水解相應的底物轉化成1μg還原糖的酶量定義為1個酶活力單位(U)。2結果2.1產(chǎn)纖維素酶活性測定結果從含腐敗秸稈的土壤中分離出7株纖維素酶產(chǎn)生菌,它們的透明圈直徑(D)、菌落直徑(H)、D/H,以及培養(yǎng)24h后CMC酶活的測定結果,如表1所示。其中S-1的D/H比值為2.33,CMC酶活為6.88U/mL,S-1表現(xiàn)出較高的產(chǎn)纖維素酶的能力。S-1在初篩培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及剛果紅染色后形成的透明圈如圖2所示。根據(jù)出發(fā)菌株S-1的16SrRNA的序列,選擇同源性較高的菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。結合理化特征,將菌株S-1鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。2.2誘導突變致死率選擇CMC酶活較高的S-1作為出發(fā)菌株,進行離子束誘變,誘變劑量的選擇參照離子束誘變細菌的劑量,離子束誘變在6個不同N2.3芽孢形態(tài)觀察在離子束誘變后的單菌落傳代培養(yǎng)過程中,發(fā)現(xiàn)有部分菌株菌落形態(tài)發(fā)生變化,如突變菌株308。如圖4所示,出發(fā)菌株S-1單菌落呈白色,圓形,中央突起,不透明,突變菌株308單菌落呈乳白色,圓形,表面粗糙,有皺褶,中央突起,邊緣透明。突變菌株308與出發(fā)菌株S-1相比形成的單菌落較小。將出發(fā)菌株S-1與突變菌株308用亞甲基藍溶液染色后在1000倍顯微鏡下進行觀察,發(fā)現(xiàn)突變菌株308的芽孢形態(tài)發(fā)生變化。出發(fā)菌株S-1的芽孢呈橢圓形,而誘變菌株308的芽孢呈圓形。低能N2.4選擇不同基因的菌株進行遺傳穩(wěn)定試驗低能N3采用酶標儀測cmc酶活法近年來,通過誘變法提高產(chǎn)纖維素酶菌株產(chǎn)纖維素酶能力的研究取得了較好的進展。埃及科學家El-Ghonemy等與傳統(tǒng)的分光光度計測酶活法相比,運用酶標儀高通量測CMC酶活法提高了工作效率,克服初篩過程中樣品量大的問題,也使初篩結果更為直觀。選用CMC酶活作為初篩指標可以更直觀的篩選出產(chǎn)酶較高的突變菌株,使整個篩選體系更簡便,篩選數(shù)據(jù)具有更高的說服力。4結論從含腐敗秸稈的土壤中篩選出產(chǎn)纖維素酶較高的菌株S-1,經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌。并運用低能N樣品采自含腐敗秸稈的土壤。1.2.5誘