2-folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量課件

Lowry’s法（Folin-酚試劑法）測(cè)定蛋白質(zhì)含量

DeterminationofproteincontentbyLowry’smethod

南方醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心Lowry’s法（Folin-酚試劑法）測(cè)定蛋白質(zhì)含量

1實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誇olin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理及其實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。掌握制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的要領(lǐng)和通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品溶液中待測(cè)定物質(zhì)含量的方法。實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誇olin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理及其實(shí)驗(yàn)2總蛋白測(cè)定經(jīng)典和常見的方法比較總蛋白測(cè)定經(jīng)典和常見的方法比較3選擇測(cè)定方法時(shí)應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質(zhì)的性質(zhì)；溶液中存在的干擾物質(zhì)；測(cè)定所花費(fèi)的時(shí)間等。選擇測(cè)定方法時(shí)應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；4本法概述1921年，F(xiàn)olin首創(chuàng)，利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)。1951年，Lowry對(duì)此法進(jìn)行了改進(jìn)，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度。本法概述1921年，F(xiàn)olin首創(chuàng)，利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸5什么是雙縮脲反應(yīng)？?jī)煞肿幽蛩丶訜崦摪笨s合成的雙縮脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子內(nèi)含有兩個(gè)鄰接的肽鍵，在堿性溶液中可與Cu2+發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色絡(luò)合物。什么是雙縮脲反應(yīng)？?jī)煞肿幽蛩丶訜崦摪笨s合成的雙縮脲（H2N-6原理1第一步：雙縮脲反應(yīng)蛋白質(zhì)分子含有大量彼此相連的肽鍵（-CO-NH-），同樣能在堿性條件下與Cu2+發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成的紫紅色絡(luò)合物（蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物）。且在540nm處的吸光度與蛋白質(zhì)的含量在10～120g/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。原理1第一步：雙縮脲反應(yīng)蛋白質(zhì)分子含有大量7原理2第二步Folin-酚顯色反應(yīng)Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物)。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚羥基的酪氨酸(Tyr)，故有此顯色反應(yīng)。

即蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。原理2第二步Folin-酚顯色反應(yīng)Foli8原理3在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比色即可求出蛋白質(zhì)的含量。即根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。原理3在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度9實(shí)驗(yàn)材料樣品

健康人血清（正常人血清蛋白質(zhì)含量：60～80g/L）試劑1.牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（200μg/ml）2.堿性硫酸銅溶液（當(dāng)日有效）3.Folin-酚試劑儀器與器材1.V-1100分光光度計(jì)2.恒溫水浴箱3.試管6支、試管架4.加樣槍、加樣槍架

實(shí)驗(yàn)材料樣品10操作步驟取6支試管，做好標(biāo)記，按下表順序操作：各管混勻，室溫放置10min。向各管內(nèi)加入Folin-酚試劑0.20ml,2s內(nèi)迅速混勻！40℃放置10min。冷卻至室溫后，以500nm波長(zhǎng)比色，用1號(hào)管作空白，讀取各管吸光度。操作步驟取6支試管，做好標(biāo)記，按下表順序操作：各管混勻，室溫11注意事項(xiàng)1Folin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性硫酸銅試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液。故當(dāng)Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。

注意事項(xiàng)1Folin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性硫酸銅12注意事項(xiàng)2因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間。即第1支試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑后，開始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。全部試管加完堿性硫酸銅試劑后若已到10分鐘，則第1支試管可立即加入0.20mLFolin-酚試劑，1分鐘后第2支試管加入0.20mLFolin-酚試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。水浴10min，冷卻后，每一分鐘測(cè)一管。注意事項(xiàng)2因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作13實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄表用各管平均A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄表用各管平均A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖14繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟1、選擇合適的坐標(biāo)紙2、畫坐標(biāo)軸3、根據(jù)測(cè)得的數(shù)據(jù)描點(diǎn)4、連線5、求實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟1、選擇合適的坐標(biāo)紙15繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線-1以A500值為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，用鉛筆繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度A蛋白質(zhì)濃度C（μg/ml）0.20.40.6....4080120160（要寫圖題）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線-1以A500值為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度16繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線-2根據(jù)所描點(diǎn)的分布情況，作直線或光滑連續(xù)的曲線，該線表示實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的平均變動(dòng)情況，因此該線不需全部通過各點(diǎn)，但應(yīng)盡量使未經(jīng)過線上的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻分布在曲線或直線兩側(cè)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線-2根據(jù)所描點(diǎn)的分布情況，作直線或光滑連續(xù)的曲線17結(jié)果計(jì)算根據(jù)未知樣品溶液的吸光度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量。然后乘以稀釋倍數(shù)（300），得出每毫升未稀釋血清含蛋白質(zhì)的微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質(zhì)的微克數(shù)(μg/ml)。血清蛋白濃度(μg/ml)=樣品蛋白質(zhì)濃度×2×300最后濃度單位換算成g/L結(jié)果計(jì)算根據(jù)未知樣品溶液的吸光度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查18本方法的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏度高，比雙縮脲法靈敏約100倍。2.操作簡(jiǎn)單，不需特殊儀器設(shè)備。缺點(diǎn)：1.費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間2.標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式3.專一性較差，干擾物質(zhì)較多。本方法的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏度高，比雙縮脲法靈敏約100倍。19復(fù)習(xí)思考題1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點(diǎn)？2、應(yīng)用本方法有哪些干擾作用？為什么？應(yīng)如何注意？

請(qǐng)將答案附在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上！復(fù)習(xí)思考題1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點(diǎn)？20值日生工作實(shí)驗(yàn)完畢，組長(zhǎng)登記實(shí)驗(yàn)室使用記錄。關(guān)閉儀器電源。清潔、歸整實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，掃地、倒垃圾?；厥赵噭簩⒀濉olin-酚試劑、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液試劑收回放至準(zhǔn)備室冰箱。堿性硫酸酮試劑（每天最后實(shí)驗(yàn)的專業(yè)負(fù)責(zé)傾倒并清洗干凈，將試劑瓶放至準(zhǔn)備室）。值日生工作實(shí)驗(yàn)完畢，組長(zhǎng)登記實(shí)驗(yàn)室使用記錄。21V-1100分光光度計(jì)操作步驟開機(jī)，預(yù)熱30分鐘轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)旋鈕，調(diào)所需波長(zhǎng)。按鍵切換到T檔將黑體放入光路中，合上蓋，按鍵校零開蓋，將參比液按空白液、標(biāo)準(zhǔn)液、待測(cè)液順序放入比色杯架上，合上蓋，按鍵切換到A檔拉動(dòng)比色架拉桿，將空白液放入光路中，合上蓋，按鍵校零拉動(dòng)拉桿，將標(biāo)準(zhǔn)、待測(cè)液依次放入光