第五章-體內藥物分析-藥學課件

1第五章體內藥物分析章飛芳華東理工大學藥學院2023年8月1日1第五章體內藥物分析章飛芳12主要內容體內樣品分析的前處理常用體內樣品的制備與貯藏23331體內樣品分析方法與方法驗證2主要內容體內樣品分析的前處理常用體內樣品的2DistributionMetabolismAbsorptionExcretion生物樣品中藥物的分析測定是定量描述藥物體內過程、獲得藥代參數(shù)的重要手段之一。藥物在體內作用DistributionMetabolismAbsorpti3定義：體內藥物分析，又稱體液藥物分析、生物藥物分析，是通過分析手段了解藥物在體內數(shù)量與質量的變化，獲得各種藥物動力學參數(shù)，代謝的方式和途徑等信息。

定義：4體內樣品的特點體內樣品（1）采集量少。（2）藥物濃度很低，一般血藥濃度在10-6-10-9g/ml之間。（3）干擾物質多。藥物經過代謝可產生一種或多種代謝物，母體藥物和代謝物又能同生物大分子結合。與常規(guī)藥物分析相比，體內藥物分析在靈敏度和選擇性等方面有較高的要求。體內樣品的特點體內樣品5體內樣品分析需經分離、濃縮、化學衍生等樣品前處理對分析方法的專屬性、靈敏度要求高分析工作量大、數(shù)據(jù)處理復雜體內藥物分析特點體內樣品分析需經分離、濃縮、化學衍生等樣品前處理體內藥物分析6第一節(jié)常用體內樣品的制備與貯藏第一節(jié)常用體內樣品的制備與貯藏7一、常用品種的種類體內樣品臟器組織體液血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液、毛發(fā)、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便等一、常用品種的種類體內臟器組織血液（血漿、血清、全血）、8

(一)血液

(1)血漿全血中加入抗凝劑(肝素、枸櫞酸、草酸鹽、EDTA等），經離心后取上清液。（2）血清全血不加抗凝劑，由血液中纖維蛋白原等影響下,引起血液凝結而析出的澄清黃色液體,離心后取上清液。

（3）全血加入抗凝劑混勻，以防凝血。

二、體內樣品的采集和貯藏二、體內樣品的采集和貯藏9血清比血漿只是少一種纖維蛋白原

C血漿=C血清

血漿比血清的分離快，而且制取量約為全血的50%-60%（血清為全血的20%-40%），多數(shù)用血漿進行分析。血漿中含有的抗凝劑對藥物濃度測定有影響時，則應使用血清樣品血清比血漿只是少一種纖維蛋白原10

(二)尿樣

尿藥測定主要用于藥物劑量回收，藥物腎清除率、藥物體內代謝及生物利用度研究。自然排尿

(二)尿樣11(三)唾液唾液中的藥物濃度通常與血液濃度相關，可用唾液中的藥物濃度來反應血漿濃度。唾液的采集一般是在漱口后15分鐘，收集，離心后，取上清液。12(三)唾液1212（四）器官組織（tissue）1．勻漿化法加入一定量的水或緩沖液，在刀片式勻漿機中勻漿，使被測藥物溶解，取上清液供萃取用—方法簡單、但回收率低組織處理的一般方法有：用于動物試驗臨床服用藥物引起中毒死亡（四）器官組織（tissue）1．勻漿化法組織處理的一般方132．沉淀蛋白法在組織勻漿中加入蛋白沉淀劑，沉淀蛋白質后取上清液供萃取用，操作簡單、但回收率低，較為常用2．沉淀蛋白法14153．酸水解或堿水解組織勻漿中加入適量的酸或堿，置水浴中加熱，待組織液化后，過濾或離心，取上清液供萃取用適用對熱穩(wěn)定的藥物，應用較少。153．酸水解或堿水解15

組織勻漿中加入適量的酶和緩沖液，置水浴上水解一定時間，待組織液化后，過濾或離心，取上清液供萃取用最常用的酶—枯草菌溶素（一種細菌性堿性蛋白分解酶，可在pH7.0~11.0較寬的范圍內使蛋白的肽鍵降解，在50~60℃具有最大活力） 4．酶水解法 4．酶水解法16

優(yōu)點—酶解法操作簡便

—避免藥物在酸及高溫下降解

—對與蛋白結合緊密的藥物，可顯著改善回收率

—可用有機溶劑直接萃取酶解液而無乳化現(xiàn)象生成

缺點—不適用于在堿性下易水解的藥物 優(yōu)點—酶解法操作簡便17（五）頭發(fā)（hair）應用—體內微量元素含量測定

—用藥史的估計

—臨床用藥和藥物非法濫用的區(qū)別

—毒性藥物檢測優(yōu)點—取樣方便、可重復缺點—預處理繁雜、干擾多

—分析對象的含量低、需精密儀器（五）頭發(fā)（hair）應用—體內微量元素含量測定18

毛發(fā)樣品的制備

1．毛發(fā)中藥物的提取—常用方法：

直接用甲醇提取

酸水解(0.1mol/L鹽酸)

堿水解(1mol/L氫氧化鈉)

酶水解(-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶)2．有機破壞法

返回第一節(jié)毛發(fā)樣品的制備 1．毛發(fā)中藥物的提取—常用方法：返回19

血漿和血清都必須在采血后即時分離。否則，血凝后冰凍保存，則因冰凍時引起細胞溶解，而阻礙血漿或血清的分出，同時因溶血而影響藥物濃度變化。冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1-2d)

冷凍—冷柜(-20℃)或低溫冷柜(-80℃)中長期保存尿樣宜立即測定，否則應加入防腐劑或低溫冷藏。三、樣品的儲存三、樣品的儲存20第二節(jié)體內樣品分析的前處理21第二節(jié)體內樣品分析的前處理2121一、生物樣品預處理的目的使藥物從綴合物及結合物中釋放

——測定藥物的總濃度

使樣品純化——消除生物基質中內源性物質的干擾

提高檢測靈敏度——適應和符合測定方法要求的靈敏度

防止分析儀器的污染和劣化——提高分析儀器的耐受程度、改善分析結果一、生物樣品預處理的目的使藥物從綴合物及結合物中釋22為什么要進行前處理?為什么要進行前處理?23為什么要進行前處理?為什么要進行前處理?24第五章-體內藥物分析-藥學ppt課件25待測生物樣品的類型決定樣品預處理方法：

血漿、血清——常需去除蛋白質

唾液——主要采用離心沉淀除去粘蛋白

尿液——常采用酸或酶法使綴合物水解

頭發(fā)——需要將頭發(fā)進行有機破壞后測定微量元素待測生物樣品的類型決定樣品預處理方法：261.去除蛋白質法溶劑沉淀法中性鹽析法強酸沉淀法熱凝固法1.去除蛋白質法272.分離與濃集液相萃取法液固萃取法超濾法

2.分離與濃集283.綴合物的水解酸水解法酶水解法容劑解法3.綴合物的水解294.化學衍生法氣相色譜：硅烷化、?；?、烷基化、不對稱衍生化液相色譜：紫外、熒光、非對映衍生化4.化學衍生法30第三節(jié)定量分析方法的驗證（一）特異性（專屬性） 內源性物質不得干擾原藥、特定的活性代謝物（二）標準曲線

r≥0.9900，至少5個濃度，不許外延（三）精密度和準確度

RSD≤15％、20％(LLOQ) 相對回收率85～115％（80～120％）第三節(jié)定量分析方法的驗證（一）特異性（專屬性）31定量分析方法的驗證

－生物樣品分析（四）最低定量限LLOQ 3~5倍t1/2，或1/10～1/20倍Cmax（五）樣品穩(wěn)定性 室溫、凍融、冰凍長期（六）提取回收率（絕對回收率） 一般低于100％，須穩(wěn)定（七）質控樣品 已知濃度樣品均勻放入待測生物樣品序列中，以確保定量測定的準確度定量分析方法的驗證

－生物樣品分析（四）最低定量限L3233名詞解釋標準物質生物介質介質效應標準樣品質控樣品質控樣品池未知樣品制備樣品分析批33名詞解釋標準物質3334研究案例34研究案例3435大鼠血清樣品中馬兜鈴酸SPE凈化及HPLC-MS含量測定35大鼠血清樣品中馬兜鈴酸SPE凈化及HPLC-MS含量測定35研究對象36研究對象3636研究對象37R1R2AAIHOCH3AAIIHHAAIIIaOHHAAIVaOHOCH3四種馬兜鈴酸結構式研究對象37R1R2AAIHOCH3AAIIHHAAI37馬兜鈴酸凈化方法38純化方法有機溶劑萃取速度加樣回收率（%）所得樣品純度液-液萃取大量乙醚，少量甲醇較慢97.3~105.0無選擇性固相萃取少量甲醇快速87.1~105.693.72~97.83%常用固相萃取材料為C18，雖然對馬兜鈴酸的富集有一定的效果，但是對強保留物質無法有效去除。馬兜鈴酸凈化方法38純化方法有機溶劑萃取速度加樣回收率（%）38SPE分離材料的選擇39SPE分離材料的選擇3939血清中馬兜鈴酸前處理方法40樣品配制活化上樣洗脫淋洗氮氣吹干，以200μL甲醇重溶，過0.22μm濾膜備用取血清，加馬兜鈴酸和內標物，作為上樣液3mL甲醇5mL純水1mL樣品3mL甲醇/水（2:98，v/v）溶液6mL三氟乙酸/甲醇（4:96，v/v）血清中馬兜鈴酸前處理方法40樣品配制活化上樣洗脫淋洗氮氣吹干40SPE洗脫條件考察41實驗分別考察了3mL甲酸/甲醇（5:100，v/v）、6mL甲酸/甲醇（5:100，v/v）作為洗脫液，結果表明，回收率僅為60.3%~62.7%。改用三氟乙酸（TFA）作為酸性介質添加。選擇三氟乙酸/甲醇（1:100，v/v）作為洗脫液，AAI回收率達到85.6%SPE洗脫條件考察41實驗分別考察了3mL甲酸/甲醇（5:141SPE洗脫條件考察421：1%TFA洗脫；2：2%TFA洗脫3：3%TFA洗脫；4：4%TFA洗脫SPE洗脫條件考察421：1%TFA洗脫；2：2%TFA洗脫42三種SPE柱效果比較43樣品添加量（ppb）C18-SAX（n=3）C18（n=3）SOLA（n=3）回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%AAI20095.58.2137.719.757.02.510078.619.063.821.055.717.1AAII100080.28.397.512.123.29.050098.113.323.148.823.524.0AAIIIa10089.16.6117.917.841.13.55091.122.033.026.748.822.5AAIVa500101.37.882.929.841.93.110092.716.242.621.940.616.8三種SPE柱效果比較43樣品添加量（ppb）C18-SAX（43液相色譜串聯(lián)質譜實驗條件44母離子(m/z)子離子(m/z)分析樣品(analyte)34046AAI31046AAII326236AAIIIa356266AAIVa馬兜鈴酸與內標物的TIC圖1馬兜鈴酸IIIa，2馬兜鈴酸IVa，3萘普生，4馬兜鈴酸II，5馬兜鈴酸I液相色譜串聯(lián)質譜實驗條件44母離子(m/z)子離子(m/z)44四種馬兜鈴酸液質聯(lián)用儀器條件45樣品標準曲線相關系數(shù)RAAIY=0.0179X-0.07360.9892AAIIY=0.00431X+0.01770.9976AAIIIaY=0.304X+0.0280.9949AAIVaY=0.0609X+0.006150.9951樣品LOQ(ng/mL)LOD(ng/mL)AAI103AAII4015AAIIIa10.3AAIVa52四種馬兜鈴酸液質聯(lián)用儀器條件45樣品標準曲線相關系數(shù)RAA45各馬兜鈴酸經SPE處理后加標回收率46

成分加入量測得量回收率%（n=3）μg/mLμg/mLxRSDAAI0.020.01