現代分子生物學課件-第五章

分子生物學研究法（上）——DNA、RNA及蛋白質操作技術

從20世紀中葉開始，分子生物學研究得到高速發(fā)展，除了基礎理論的重大突破，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術的進步。分子生物學研究法（上）1

基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學研究的核心與基本技術。基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、核酸2

基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其它載體分子，構成遺傳物質的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達?；蚬こ淌侵冈隗w外將核酸分子插入病毒、質?；?

基因工程技術是核酸操作技術的一部分，只不過它強調了外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達。事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細胞之中的能力，是基因工程技術區(qū)別于其它技術的根本特征?；蚬こ碳夹g是核酸操作技術的一部分，只不過它4現代分子生物學ppt課件-第五章55.1重組DNA技術回顧三大成就：第一，在20世紀40年代確定了遺傳信息的攜帶者、即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質——解決了遺傳的物質基礎問題；第二，50年代提出了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機制——解決了基因的自我復制和世代交替問題；5.1重組DNA技術回顧6第三，50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼——闡明了遺傳信息的流動與表達機制。第三，50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學7表5-1重組DNA技術史上的主要事件年份事件1869FMiescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現了DNA聚合酶I。1959-1960Ochoa發(fā)現RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一個遺傳密碼；Jacob和Monod提出了調節(jié)基因表達的操縱子模型。1964Yanofsky和Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關系。1965Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定；科學家證明細菌的抗藥性通常由“質?！盌NA所決定。表5-1重組DNA技術史上的主要事件年份事81966Nirenberg，Ochoa，Khorana，Crick等人破譯了全部遺傳密碼。1967第一次發(fā)現DNA連接酶1970Smith，Wilcox和Kelley分離了第一種限制性核酸內切酶，Temin和Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現反轉錄酶。1972-1973Boyer，Berg等人發(fā)展了DNA重組技術，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細菌基因克隆。1975-1977Sanger與Maxam和Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測定技術，1977年完成了全長5387bp的噬菌體φx174基因組測定。1978首次在大腸桿菌中生產由人工合成基因表達的人腦激素和人胰島素。1980美國聯邦最高法院裁定微生物基因工程可以被專利化。1981Palmiter和Brinster獲得轉基因小鼠，Spradling和Rubin得到轉基因果蠅。1982美、英批準使用第一例基因工程藥物——胰島素，Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。1966Nirenberg，Ochoa，Khorana，Cr91983獲得第一例轉基因植物。1984斯坦福大學獲得關于重組DNA的專利。1986GMO首次在環(huán)境中釋放。1988Watson出任“人類基因組計劃”首席科學家。1989DuPont公司獲得轉腫瘤基因小鼠—“Oncomouse”。1992歐共體35個實驗室聯合完成酵母第三染色體全序列測定(315kb)。1994第一批基因工程西紅柿在美國上市。1996完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測定。1997英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。2000完成第一個高等植物擬南芥的全序列測定（(1.15×108bp)。2001完成第一個人類基因組全序列測定(2.7×109bp)。1983獲得第一例轉基因植物。1984斯坦福大學獲得關于重組10

限制性核酸內切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點切開DNA分子。第一個核酸內切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個位點切開并產生具有粘性末端或平端的小片段。

（1）限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個11圖5-1幾種主要DNA內切酶所識別的序列及其酶切末端。圖5-1幾種主要DNA內切酶所識別的序列及其酶切末端。12

圖5-2DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體。a.DNA的粘性末端;b.DNA的平末端;c.化學合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。（2）DNA連接酶

圖5-2DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體。13

僅僅能在體外利用限制性核酸內切酶和DNA連接酶進行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上，才能在寄主細胞中進行繁殖。具備自主復制能力的DNA分子就是分子克隆的載體（vector）。病毒、噬菌體和質粒等小分子量復制子都可以作為基因導入的載體。（3）分子克隆的載體僅僅能在體外利用限制性核酸內切酶和DNA連接酶進行DNA14

圖5-3重組DNA操作過程示意圖

15目的基因的表達目的基因的表達16現代分子生物學ppt課件-第五章17現代分子生物學ppt課件-第五章18現代分子生物學ppt課件-第五章19現代分子生物學ppt課件-第五章205.2DNA基本操作技術5.2.1核酸凝膠電泳技術

自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術，已經發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段。5.2DNA基本操作技術21

一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當的電極。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數成正比，與片段大小成反比。一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移22

生理條件下，核酸分子中的磷酸基團呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離子（polyanions），在電場中向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。生理條件下，核酸分子中的磷酸基團呈離子化狀態(tài)，所以，D23瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個堿基對之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。24表5-2瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力

凝膠類型及濃度分離DNA的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1表5-2瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力25

在凝膠電泳中，加入溴化乙錠（ethidiumbromide，EtBr）染料對核酸分子進行染色，然后放置在紫外光下觀察，可靈敏而快捷地檢測出凝膠介質中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。在凝膠電泳中，加入溴化乙錠（ethidiumbro26溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相鄰堿基之間，并在300nm波長的紫外光照射下發(fā)出熒光。溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分27圖5-4溴化乙錠染料的化學結構及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現出橘黃色熒光，易于鑒定。

圖5-4溴化乙錠染料的化學結構及其對DNA分子的插入作用。28現代分子生物學ppt課件-第五章295.2.2細菌轉化與目標DNA分子的增殖

所謂細菌轉化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA而導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉化DNA的細菌菌株則被稱為受體菌株。

5.2.2細菌轉化與目標DNA分子的增殖30轉化(transformation)

特指以質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。轉染(transfection)

是指噬菌體、病毒或以它作為載體構成的重組子導入細胞的過程。轉導(transduction)

以噬菌體為媒介，將外源DNA導入細菌的過程。上述概念往往容易混淆。轉化(transformation)31

轉化是一個自然存在的過程。細菌處于容易吸收外源DNA狀態(tài)叫感受態(tài)，用理化方法誘導細胞進入感受態(tài)的操作叫致敏過程。重組DNA轉化細菌的技術操作關鍵就是通過化學方法，人工誘導細菌細胞進入一個敏感的感受態(tài)，以便外源DNA進入細菌內。這項技術始于Mandel和Higa1970年的觀察，他們發(fā)現細菌經過冰冷的CaCl2溶液處理及短暫熱休克后，容易被λ噬菌體DNA感染，隨后Cohn于1972年進一步證明質粒DNA用同樣的方法也可進入細菌。轉化是一個自然存在的過程。細菌處于容易吸收外32轉化原理：將快速生長中的大腸桿菌置于經0℃預處理的低滲氯化鈣溶液中，使細胞膨脹，細胞膜通透性發(fā)生變化，易與外源DNA相粘附并在細胞表面的復合物。42℃下做短暫熱刺激，復合物便會被細胞所吸收。在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉化基因實現表達，就可涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉化子。細菌轉化及藍白斑篩選：圖5-5轉化原理：33圖5-6λ噬菌體可以作為克隆載體圖5-6λ噬菌體可以作為克隆載體34現代分子生物學ppt課件-第五章355.2.3聚合酶鏈反應技術（PCR）

首先將雙鏈DNA分子加熱分離成兩條單鏈，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應混合物中的四種dNTP合成新生的DNA互補鏈。因為DNA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來啟動（“引導”）新鏈的合成，所以，新生DNA鏈的起點由寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火位點所決定。5.2.3聚合酶鏈反應技術（PCR）36

由于在PCR反應中所選用的一對引物，是按照與擴增區(qū)段兩端序列彼此互補的原則設計的，因此每一條新生鏈的合成都是從引物的退火結合位點開始并朝相反方向延伸的。由于在PCR反應中所選用的一對引物，是按照與擴增區(qū)37

整個PCR反應的全過程，即DNA解鏈（變性）、引物與模板DNA相結合（退火）、DNA合成（鏈的延伸）三步，可以被不斷重復。經多次循環(huán)之后，反應混合物中所含有的雙鏈DNA分子數，即兩條引物結合位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數，理論上的最高值應是2n。整個PCR反應的全過程，即DNA解鏈（變性）、引物38圖5-8PCR指數擴增時循環(huán)次數與DNA產物數量的比較。圖5-8PCR指數擴增時循環(huán)次數與DNA產物數量的比較。39主要步驟：將含有待擴增DNA樣品的反應混合物放置在高溫（>94℃）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA。主要步驟：40

然后降低反應溫度（約50℃），致冷1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA發(fā)生退火作用并結合在靶DNA區(qū)段兩端的互補序列位置上。然后降低反應溫度（約50℃），致冷1分鐘，使寡核苷酸41最后，將反應混合物的溫度上升到72℃左右保溫1-數分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互補鏈。最后，將反應混合物的溫度上升到72℃左右保溫1-數分鐘，在D42聚合酶鏈式反應示意圖。（a）起始材料，雙鏈DNA；（b）反應混合物加熱后發(fā)生鏈分離，降溫使引物結合到待擴增靶DNA區(qū)段兩端的退火位點上；（c）Taq聚合酶以單鏈DNA為模板在引物的引導下利用反應混合物中的dNTPs合成互補的新鏈DNA；（d）將反應混合物再次加熱，使舊鏈和新鏈分開；（e）合成新的互補鏈DNA；（f）重復b；（g）重復c、、、、、、聚合酶鏈式反應示意圖。（a）起始材料，雙鏈DNA；（b）反應43引物設計一般遵循下列原則：

(1)引物長度以15~30bp為宜。

(2)引物堿基盡可能隨機分布，避免出現嘌呤、嘧啶堆積現象，引物G+C含量宜在45~55%左右。(3)引物內部不應形成二級結構，兩個引物之間尤其在3'末端不應有互補鏈存在。(4)引物的堿基順序不應與非擴增區(qū)域有同源性。要求在引物設計時采用計算機進行輔助檢索分析。(5)引物3‘末端堿基:原則上要求引物3’末端與模板DNA一定要配對。

(6)引物5'末端堿基:PCR反應物5'末端堿基并沒有嚴格的限制，只要與模板DNA結合的引物長度足夠，其5'末端堿基可以不與模板DNA匹配而呈游離狀態(tài)。

引物設計一般遵循下列原則：44PCR反應引物設計:PCR作為一個體外酶促反應，其效率和特異性取決于兩個方面:一是引物與模板的特異結合二是多聚酶對引物的有效延伸基因組DNA作為模板時，由于其數量的龐大及結構復雜，除了特異擴增外，往往很容易產生非特異性擴增產物。引物設計的總原則就是提高擴增的效率和特異性。PCR反應引物設計:455.2.4實時定量PCR（Realtime-PCR）

普通PCR擴增產物總量變化大。實時定量PCR技術：利用帶熒光檢測的PCR儀對PCR過程DNA累積作出動態(tài)監(jiān)測。熒光染料：SYBRGreenI：圖5-9TaqMan探針：圖5-105.2.4實時定量PCR（Realtime-PCR）465.2.5基因組DNA文庫構建

基因組DNA文庫構建：把某種生物基因組DNA切成適當大小，分別與載體組合，導入微生物細胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克隆，稱為基因組DNA文庫?；蚪MDNA文庫構建示意圖：圖5-13常用載體：噬菌體；柯斯質粒；BAC；PAC；YAC5.2.5基因組DNA文庫構建475.3RNA基本操作技術在DNA水平上分離真核生物的靶基因難度大：基因組DNA龐大；大量重復序列；有內含子。而分離mRNAcDNA目的基因工作簡單，速度快。但是，RNA分子：敏感，穩(wěn)定性差，某些基因的mRNA具有時相和轉錄的特殊性。5.3RNA基本操作技術485.3.1總RNA的提取1、操作要求高：選擇合適的時相、采用適當的條件與材料，避免降解。2、方法：Trizol法。由苯酚和異硫氰酸胍組成，可迅速破壞細胞結構，使RNA釋放，并保持RNA完整。3、濃度和純度鑒定：通過OD260/OD280的比值來鑒定5.3.1總RNA的提取495.3.2mRNA的純化

根據mRNA3’端具有polyA尾巴的特點，利用寡聚（dT）-纖維素柱色譜法純化獲得高純度的mRNA。圖5-145.3.2mRNA的純化50圖5-14PolyATtractmRNA的分離純化過程簡圖圖5-14PolyATtractmRNA的分離純化過程簡515.3.3cDNA的合成使用oligodT或隨機引物，通過RT-PCR法（——逆轉錄酶）。圖5-15定向cDNA的合成與分子修飾：圖5-165.3.3cDNA的合成52圖5-15cDNA合成過程示意圖圖5-15cDNA合成過程示意圖535.3.4cDNA文庫的構建獲得的含有某種組織器官cDNA信息的噬菌體文庫，可用于篩選目的基因、大規(guī)模測序、基因芯片雜交等功能。做法：mRNAcDNA載體大腸桿菌一個完整的cDNA文庫通常包含大于500000的獨立克隆。5.3.4cDNA文庫的構建545.3.5基因文庫的篩選通過某種特定的方法從基因文庫中鑒定出含有所需DNA分子的特定克隆過程。1、核酸雜交法（Sourthernblotting）：圖5-172、PCR篩選法3、免疫篩選法（Westernblotting）：該法適用于對表達文庫的篩選。圖5-185.3.5基因文庫的篩選555.4SNP的理論與應用SNP：singlenucleotidepolymorphism，單核苷酸多態(tài)性。具有很高的遺傳穩(wěn)定性，是繼限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、RAPD和微衛(wèi)星DNA（SSR）標記之后的第三代遺傳標記。5.4SNP的理論與應用56RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphisma）技術

RFLP標記是發(fā)展最早的DNA標記技術。RFLP是指基因型之間限制性片段長度的差異，這種差異是由限制性酶切位點上堿基的插入、缺失、失重排或點突變所引起的。RFLP技術主要包括以下基本步驟：

DNA提取→用限制性內切酶酶切DNA→用凝膠電泳分開DNA片段→把DNA片段轉移到濾膜上→利用放射性標記的探針雜交顯示特定的DNA片段（Southern雜交）和結果分析。

RFLP（RestrictionFragmentLeng57現代分子生物學ppt課件-第五章58現代分子生物學ppt課件-第五章59RAPD技術RAPD（(RandomAmplifiedPolymorphicDNA）技術是建立在PCR(PolymeraseChainReaction)基礎之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態(tài)性分析的分子技術。其以基因組DNA為模板,以單個人工合成的隨機多態(tài)核苷酸序列(通常為10個堿基對)為引物,在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq酶)作用下,進行PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后,在紫外透視儀上檢測多態(tài)性。擴增產物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。RAPD技術現已廣泛的應用于生物的品種鑒定、系譜分析及進化關系的研究上。RAPD技術RAPD（(RandomAmplifiedP60現代分子生物學ppt課件-第五章61SSR（simplesequencerepeats）技術微衛(wèi)星DNA：重復單位序列最短，只有2～6bp，串聯成簇，長度50～100bp，又稱為短串聯重復序列（ShortTandemRepeatSTR)。廣泛分布于基因組中。SSR標記的基本原理：根據微衛(wèi)星序列兩端互補序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯重復數目不同，因而能夠用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產物，將擴增產物進行凝膠電泳，根據分離片段的大小決定基因型并計算等位基因頻率。

SSR（simplesequencerepeats）技術62SNP檢測技術傳統SNP檢測方法：RFLP、PCR-SSCP、DHPLC等，最終均需通過凝膠電泳分析，通量受到限制，并只能判斷有無，而不知堿基類型。必須進行DNA測序。基因分型：利用數據庫已有SNP進行特定人群序列和發(fā)生頻率研究，包括如下方法：SNP檢測技術631、基因芯片技術：通過優(yōu)化芯片雜交程序，使探針只與完全互補的序列雜交，而不與含有單個錯配堿基序列雜交。2、Taqman技術：運用了熒光共振能量轉換（FRET）技術。3、分子信標技術：也運用了FRET技術。4、焦磷酸測序法1、基因芯片技術：通過優(yōu)化芯片雜交程序，使探針只與完全互補的64SNP的應用1、人類基因單體的繪圖2、SNP與疾病易感基因的相關性分析3、指導用藥與藥物設計SNP的應用655.5基因克隆技術在多細胞的高等生物個體水平上，人們用克?。╟lone）表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數個個體組成的群體。在細胞水平上，克隆是指由同一個祖細胞分裂而來的一群帶有完全相同遺傳物質的子細胞。5.5基因克隆技術66

在分子生物學中，人們把將外源DNA插入具有復制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復制的過程稱為克?。▌釉~）。現代分子生物學ppt課件-第五章67基因克隆，包括目的基因的分離和鑒定兩個內容，分四個基本步驟：(1)DNA材料的選擇與片段化；(2)外源DNA片段與載體分子的體外連接反應；(3)將人工重組的DNA分子導入它們能夠進行正常復制的寄主細胞；(4)重組轉化子克隆的選擇或篩選。*真核生物基因（大，有重復序列）———cDNA克隆法法。

基因克隆，包括目的基因的分離和鑒定兩個內容，分四個基本步驟：68RACE（RaidamplificationofcDNAends）技術是一項在已知cDNA序列（部分）的基礎上克隆5’或3’端缺失序列的技術。主要操作步驟如圖5-22所示。RACE技術除了用于獲得全長cDNA序列外，還被應用于識別獲得5’和3’端非轉錄序列。5.5.1RACE技術RACE（RaidamplificationofcDN69該法通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴增目的基因片段。因為Tester和Driver在接受差示分析前均經一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息能被擴增。5.5.2應用cDNA差示分析法克隆基因該法通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法70圖5-23RDA流程圖。圖5-23RDA流程圖。711、基因大規(guī)模克隆的目的Gateway技術利用噬菌體進行位點特異性DNA片段重組，實現不需要傳統的酶切連接過程的基因快速克隆和載體間平行轉移，為大規(guī)?？寺』蚪M注釋的可譯框架提供了保障。

2、Gateway克隆技術要點（1）Topo反應：將目的基因PCR產物連入Entry載體（2）LR反應：將目的片斷從Entry載體重組入表達載體圖5-24a，5-24b。5.5.3Gateway大規(guī)模克隆技術1、基因大規(guī)?？寺〉哪康?.5.3Gateway大規(guī)?？?2圖5-24Gateway大規(guī)?？寺〔呗詧D5-24Gateway大規(guī)?？寺〔呗?3基因的圖位克隆法（Map-basedcloning