實(shí)驗(yàn)七營養(yǎng)缺陷型菌株篩選課件

營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選實(shí)驗(yàn)七營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選實(shí)驗(yàn)七營養(yǎng)缺陷型等基本概念與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個(gè)體：野生型：指從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生人為營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株。遺傳型表示法是[A+B+]

營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)誘變處理后，由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長。

A營養(yǎng)缺陷型用[A-B+]表示，B營養(yǎng)缺陷型用[A+B-]表示原養(yǎng)型：一般指營養(yǎng)缺陷型突變經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。遺傳型均用[A+B+]表示營養(yǎng)缺陷型等基本概念與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個(gè)體：與營養(yǎng)要求有關(guān)的3種遺傳型關(guān)系與營養(yǎng)要求有關(guān)的3種遺傳型關(guān)系培養(yǎng)基的基本概念

（按營養(yǎng)需求成分分）與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類培養(yǎng)基：

基本培養(yǎng)基（MM）：僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需要的最低成分的組合培養(yǎng)基?！煌甑囊蟛煌嗽囼?yàn)要先確定，非常重要。完全培養(yǎng)基（CM）：凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基：凡只能滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷突變株生長需要的組合或半組合培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的基本概念

（按營養(yǎng)需求成分分）與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株?duì)I養(yǎng)缺陷型的用途營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大，主要有兩方面應(yīng)用：1、是作為研究代謝途徑和遺傳規(guī)律及育種技術(shù)不可少的標(biāo)記菌種；2、可直接用于生產(chǎn)氨基酸、核苷酸等代謝產(chǎn)物——目的在于切斷某些代謝途徑以積累中間代謝產(chǎn)生或切斷一條代謝途徑而積累另一分支途徑的末端產(chǎn)生?！獬x途徑中的反饋抑制和阻遏。營養(yǎng)缺陷型的用途營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大，目的要求1、了解應(yīng)用物理、化學(xué)因素對細(xì)菌進(jìn)行誘變的方法。2、初步掌握誘變產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選與鑒定的方法技術(shù)。體會(huì)其相應(yīng)的科學(xué)理念。目的要求1、了解應(yīng)用物理、化學(xué)因素對細(xì)菌進(jìn)行誘變的方法。實(shí)驗(yàn)原理

——誘變及誘變劑說明利用化學(xué)、物理等誘變手段誘發(fā)突變是遺傳學(xué)研究和育種工作的常用手段。主要有DNA堿基化學(xué)性質(zhì)改變引起置換、插入移碼、大片段畸變、堿基二聚體形成等。最終引起遺傳信息在復(fù)制中的改變。本次實(shí)驗(yàn)利用紫外線進(jìn)行誘變處理（主要是形成嘧啶二聚體，引起后續(xù)DNA復(fù)制錯(cuò)誤，達(dá)到誘變的目的）。誘變后需要暗培養(yǎng)（防止光復(fù)活作用）。紫外線劑的控制——紫外燈的功率、照射距離、照射時(shí)間?！ㄐ枰捌谠囼?yàn)確定，殺菌率在70%左右）實(shí)驗(yàn)原理

——誘變及誘變劑說明利用化學(xué)、物理等誘變手段誘發(fā)突實(shí)驗(yàn)原理

——營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)生長情況營養(yǎng)缺陷型在完全培養(yǎng)基（CM）上生長良好，而在基本培養(yǎng)基（MM）上則不生長；未發(fā)生突變的野生型在兩種培養(yǎng)基上都能生長?！Y選的理論依據(jù)實(shí)驗(yàn)原理

——營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)生長情況營養(yǎng)缺陷型在完全培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)原理

——營養(yǎng)缺陷型篩選的四個(gè)環(huán)節(jié)第一步：誘變劑處理第二步：淘汰野生型，濃縮缺陷型——基本培養(yǎng)基（使?fàn)I養(yǎng)缺陷型由少數(shù)變?yōu)槎鄶?shù)）

抗生素法：青霉素適用于細(xì)菌；制霉菌素適用于真菌

菌絲過濾法：適用于絲狀生長的真菌和放線菌高溫殺菌法：利用芽孢和營養(yǎng)體對熱敏感性的差異。第三步：檢出缺陷型第四步：鑒定營養(yǎng)缺陷型（此步因時(shí)間關(guān)系不再進(jìn)行）實(shí)驗(yàn)原理

——營養(yǎng)缺陷型篩選的四個(gè)環(huán)節(jié)第一步：誘變劑處理實(shí)驗(yàn)材料菌種：大腸桿菌實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：肉湯液體培養(yǎng)基（CM）；肉湯固體培養(yǎng)基（CMA）；2倍肉湯液體培養(yǎng)基（2×CM）；基本液體培養(yǎng)基（MM）；基本固體培養(yǎng)基（MMA）；無N基本液體培養(yǎng)基（無N）；2倍含N基本液體培養(yǎng)基（2×N）實(shí)驗(yàn)試劑：生理鹽水；青霉素鈉實(shí)驗(yàn)器材：10mL帶蓋離心管、10mL吸管、90mm培養(yǎng)皿、15×150mm試管（帶硅膠塞）、1mL刻度吸管（或微量加樣槍和吸頭）實(shí)驗(yàn)材料菌種：大腸桿菌實(shí)驗(yàn)步驟1、菌種培養(yǎng)收集洗滌2、誘變劑處理3、淘汰野生型，濃縮缺陷型——基本培養(yǎng)基

抗生素法：青霉素適用于細(xì)菌；制霉菌素適用于真菌

菌絲過濾法：適用于絲狀生長的真菌和放線菌4、檢出缺陷型——夾層培養(yǎng)法5、鑒定營養(yǎng)缺陷型（此步驟因時(shí)間關(guān)系不再進(jìn)行）——下學(xué)期《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》中有相關(guān)內(nèi)容學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)步驟1、菌種培養(yǎng)收集洗滌1、菌種培養(yǎng)收集洗滌

（第一天）大腸桿菌接種于肉湯液體培養(yǎng)基，37℃靜止培養(yǎng)18~24小時(shí)（老師處理）。無菌取10mL培養(yǎng)液放入無菌15mL離心管中，3500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清液，留下菌體沉淀。在上述沉淀中加入5mL無菌生理鹽水，懸浮沉淀（均勻），備用。1、菌種培養(yǎng)收集洗滌

（第一天）大腸桿菌接種于肉湯液體培養(yǎng)基2、誘變劑處理（第一天）吸取上述洗滌懸浮好的菌懸液3mL，放至60mm培養(yǎng)皿中，搖晃成薄層。將上述培養(yǎng)皿（連蓋）放在40W的紫外燈下，距離30厘米（處理前先開紫外燈穩(wěn)定30分鐘），滅菌1分鐘，然后開蓋處理5分鐘。照射完畢后，先蓋上皿蓋，再關(guān)紫外燈。吸取3毫升2倍肉湯培養(yǎng)液到上述處理后的培養(yǎng)皿中。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，避光培養(yǎng)12小時(shí)以上。——誘變后DNA復(fù)制形成純合子過程。注意紫外線防護(hù)（不要長時(shí)間暴露在其下）。2、誘變劑處理（第一天）吸取上述洗滌懸浮好的菌懸液3mL，放3、淘汰野生型，濃縮缺陷型

（第二天）（1）吸5毫升紫外線處理過并重新培養(yǎng)的菌液，放入已滅菌的15mL離心管，3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。（2）倒去上清液，加入5mL生理鹽水，打散混勻沉淀，如此重復(fù)離心洗滌三次，加生理鹽水到原體積（5mL）。（3）吸取經(jīng)離心洗滌的菌液0.1毫升于5毫升無N基本培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)12~24小時(shí)?！睜I養(yǎng)情況下休眠菌體（饑餓處理）。3、淘汰野生型，濃縮缺陷型

（第二天）（1）吸5毫升紫外線處3、淘汰野生型，濃縮缺陷型

（第三天）（4）培養(yǎng)24小時(shí)后，按1∶1加入2N基本培養(yǎng)液5毫升（含青霉素鈉鹽2000單位/毫升），使青霉素鈉在菌液中的最終濃度約為1000單位/毫升，再放入37℃溫箱中培養(yǎng)?！们嗝顾刂蛔饔糜谏L的細(xì)胞，殺死在基本培養(yǎng)基中生長的野生型，留下休眠不生長的缺陷型。（5）培養(yǎng)24小時(shí)后，3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，用基本液體培養(yǎng)基重復(fù)離心洗滌三次，懸浮于5mL基本培養(yǎng)液，備用?！コ嗝顾剽c（第四天內(nèi)容）3、淘汰野生型，濃縮缺陷型

（第三天）（4）培養(yǎng)24小時(shí)后，4、檢出缺陷型——夾層培養(yǎng)法

（第四天）取1無菌培養(yǎng)皿，倒入5mL滅菌溶化后基本固體培養(yǎng)基（MMA），鋪滿鋪平培養(yǎng)皿皿底，凝固后形成底層?！谝粚尤∩弦徊襟E處理好后的菌懸液0.1mL加入到5mL滅菌溶化后冷卻至45-50℃基本固體培養(yǎng)基（MMA）中（試管），快速搓動(dòng)混勻后（快速），倒入上述有底層的培養(yǎng)皿中，鋪滿鋪平，冷卻凝固?！诙永鋮s凝固后，再倒入5mL滅菌溶化后冷卻至45-50℃基本固體培養(yǎng)基（MMA），鋪滿鋪平，冷卻凝固。——第三層放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時(shí)。4、檢出缺陷型——夾層培養(yǎng)法

（第四天）取1無菌培養(yǎng)皿，倒入培養(yǎng)好后，仔細(xì)觀察培養(yǎng)皿，標(biāo)記已生長出的菌落。標(biāo)記好后，倒入5mL滅菌溶化后冷卻至45-50℃肉湯固體培養(yǎng)基（CMA），鋪滿鋪平，冷卻凝固?！谒膶印诹靸?nèi)容放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時(shí)?！诎颂靸?nèi)容再次仔細(xì)觀察培養(yǎng)好培養(yǎng)皿，前后對照標(biāo)記，找出新生長出的菌落，此菌落可能是缺陷型菌落。如有新生長出的菌落，用無菌牙簽（接種針），挑取菌落，分別點(diǎn)接于含基本固體培養(yǎng)基（MMA）和肉湯固體培養(yǎng)基（CMA）培養(yǎng)皿上，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時(shí)。觀察，如果在基本固體培養(yǎng)基（MMA）無生長，而肉湯固體培養(yǎng)基（CMA）生長，則得到營養(yǎng)缺陷型菌株，保藏進(jìn)行鑒定營養(yǎng)缺陷型。反之失敗。培養(yǎng)好后，仔細(xì)觀察培養(yǎng)皿，標(biāo)記已生長出的菌落。夾層培養(yǎng)法及其結(jié)果示意圖夾層培養(yǎng)法及其結(jié)果示意圖5、鑒定營養(yǎng)缺陷型利用生長譜法確定所挑取菌株具體缺少什么營養(yǎng)物而不能生長。生長譜法：在混有供試菌（待鑒定菌）的平板表面點(diǎn)加相應(yīng)微量營養(yǎng)物，視某營養(yǎng)物的周圍有否長菌（微型菌落圈）來確定該供試菌的營養(yǎng)要求的一種快速、直觀的方法。下學(xué)期《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》再具體詳細(xì)介紹。5、鑒定營養(yǎng)缺陷型利用生長譜法確定所挑取菌株具體缺少什么營養(yǎng)附：檢出營養(yǎng)缺陷型的方法介紹夾層培養(yǎng)法——四層培養(yǎng)基（三基本一完全）限量補(bǔ)充培養(yǎng)法——微量富（限）營養(yǎng)物逐個(gè)檢出法——滅菌接種針或牙簽，分別接種于基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基影印平板法——分別轉(zhuǎn)印于基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上附：檢出營養(yǎng)缺陷型的方法介紹夾層培養(yǎng)法——四層培養(yǎng)基（三基本夾層培養(yǎng)法及其結(jié)果夾層培養(yǎng)法及其結(jié)果夾層培養(yǎng)法先在培養(yǎng)皿上倒一層MM瓊脂培養(yǎng)基，凝固后倒上一層含菌的MM瓊脂培養(yǎng)基，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24hr，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時(shí)第二批長出的菌落就可能是缺陷型。缺點(diǎn)：結(jié)果有時(shí)不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。夾層培養(yǎng)法先在培養(yǎng)皿上倒一層MM瓊脂培養(yǎng)基，凝固后倒上一層含限量補(bǔ)充培養(yǎng)法

——營養(yǎng)不同，生長差異該法有兩種情況：（1）目的是檢出營養(yǎng)缺陷型（廣泛）將富集培養(yǎng)后的細(xì)胞接種到含有0.01%蛋白胨的MM固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，野生型迅速長成大菌落，而生長緩慢的小菌落可能是營養(yǎng)缺陷型。（2）目的是定向篩選某種特定的缺陷型（特定）在基本培養(yǎng)基中加入某種單一（微量）的氨基酸、維生素或堿基等物質(zhì)。限量補(bǔ)充培養(yǎng)法

——營養(yǎng)不同，生長差異該法有兩種情況：逐個(gè)檢出法（點(diǎn)接）用接種針或牙簽將誘變處理后CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種（先MM后CM，操作時(shí)要避免帶入CM培養(yǎng)基成分），依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。此法結(jié)果明確，但工作量大。CMMM逐個(gè)檢出法（點(diǎn)接）用接種針或牙簽將誘變處理后CM上長出的菌落影印平板法（1）將一較培養(yǎng)皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。（2）完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標(biāo)記方位。（3）將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。（4）將CM和MM在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（5）二平皿相同