基因工程抗體及其發(fā)展前景

基因工程抗體及其發(fā)展前景第1頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容第一節(jié):基因工程抗體的基本原理：第二節(jié):人源化抗體制備的主要方法：第三節(jié):抗體靶向治療的新的思考：第四節(jié):工程抗體的未來發(fā)展與展望：第2頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)：基因工程抗體的基本原理

(antibodyengineering）第3頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月Antibodyhasahigherspecificityandaffinitytobindtotargetprotein.

藥物(drug)：是一類分子（化學(xué)合成物，蛋白質(zhì)，核酸等）可以干擾人體內(nèi)細(xì)胞生命過程中一些重要的生理和病理活動(dòng)或通路。第4頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月基因抗體：通過基因工程手段，保留抗體重輕鏈可變區(qū)中主要與抗原結(jié)合的CDR功能區(qū),而形成的各種功能抗體．Complementary-determiningregions:CDR第5頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程抗體的分類第6頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程抗體的分類2.小分子抗體（1）Fab片段（2）單鏈抗體（singlechainantibody，scFv）、雙鏈抗體、三鏈抗體（3）微型抗體（minibody，兩個(gè)scFv與抗體CH3區(qū)連接）（4）雙特異性抗體（diabody）（5）其他形式抗體（細(xì)胞內(nèi)抗體、催化抗體、免疫脂質(zhì)體、最小結(jié)合單位等）第7頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月抗體藥物在應(yīng)用中存在的問題：一般必須用小鼠骨髓瘤制備單抗，故所得鼠源性單抗，必須人源化，在臨床上可減少異源性蛋白所引起的過敏反應(yīng)和增加療效。鼠源抗體人源化后，抗體效價(jià)明顯降低，導(dǎo)致臨床療效降低。臨床治療需要大量的抗體(克級(jí)），故需要生物反應(yīng)器制備抗體。由于抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量受到限制，而影響療效。問題:工程細(xì)胞系,大規(guī)模生產(chǎn)工藝技術(shù)第8頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程抗體的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：不受動(dòng)物品系（species)和抗體類型（isotype)的限制。利用嵌合抗體，使鼠源抗體人源化，減少潛在的抗原表位，增強(qiáng)抗體的療效。全人源化抗體，可以降低抗體的異源性和免疫源性，最大化提升抗體的的療效。缺點(diǎn)：抗體的親和力減弱，與完整抗體結(jié)構(gòu)相比，功能明顯降低。第9頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月目的：減小鼠源性成份，降低HAMS反應(yīng)（humanagainstmousesyndrome)。易于大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用于臨床。保留抗體的抗原結(jié)合能力?；驹恚航柚蚬こ淌侄?，將編碼Ab的重輕鏈可變區(qū)基因重組到真核表達(dá)載體上并進(jìn)行表達(dá)。第10頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程抗體的表達(dá)原核細(xì)胞和酵母可以用于表達(dá)小分子抗體和抗體片段大部分完整抗體和雙鏈抗體、微型抗體等需要在CHO等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)利用完整的動(dòng)植物體通過轉(zhuǎn)基因的方法表達(dá)外源蛋白：如利用轉(zhuǎn)基因煙草生產(chǎn)抗狂犬病毒抗體第11頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月抗體工程的發(fā)展歷程動(dòng)物多克隆抗血清被抗生素所代替成份復(fù)雜，副反應(yīng)嚴(yán)重鼠源單克隆抗體1975年，雜交瘤技術(shù)制備單抗成功“魔彈”HAMA反應(yīng)20世紀(jì)90年代初，抗內(nèi)毒素單抗用于治療膿毒敗血癥遭遇失敗?？贵w藥物的研究進(jìn)入低谷。分子生物學(xué)基因工程技術(shù)基因工程抗體鼠源抗體的人源化及形式多樣的改造抗體抗體工程就是指利用分子生物學(xué)、基因工程等手段對(duì)抗體進(jìn)行各種不同的改造并在原核、真核細(xì)胞中表達(dá)制備的工程技術(shù)。馬血清,破傷風(fēng),狂犬病第12頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月TheEvolutionofTherapeuticAntibodiesMurineFullyHumanHumanizedChimeric100%mouseprotein34%mouseprotein5-10%mouseprotein100%humanproteinPotentialforImmunogenicityHighLowLonbergN.NatBiotechnol.2005;23:1117-1125.TernantD,etal.ExpertOpinBiolTher.2005;5(Suppl1):S37-S47.

YangX-D,etal.CritRevOncolHematol.2001;38:17-23.WeinerLM.JImmunother.2006;29:1-9..嵌合抗體人源化抗體全人抗體第13頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)：基因工程抗體制備的主要方法：第15頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月1.人鼠嵌合抗體

（ChimericAntibodies）原理：利用基因重組技術(shù)，把鼠抗體的重輕鏈可變區(qū)部分與人抗體重輕鏈恒定區(qū)的進(jìn)行重組，減少鼠源結(jié)構(gòu)，增加人源結(jié)構(gòu)，而保持抗體與原抗原的特異性結(jié)合。缺點(diǎn)：鼠抗體部分亦能作為一種異種抗原，多次反復(fù)使用在人體產(chǎn)生抗體及過敏反應(yīng)（HAMS反應(yīng)，humanagainstmousesyndrome)。嵌合抗體可保持特異性結(jié)合和外源性抗原降低，但親和力明顯下降。第16頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月Chimericantibodies雜交瘤細(xì)胞株獲得兩個(gè)可變區(qū)克隆載體(T載體)原核表達(dá)系統(tǒng)檢測構(gòu)建表達(dá)載體RT-PCR酶切測序酶切，連接轉(zhuǎn)化是是否否酶切，連接1。獲得鼠單抗重輕鏈可

變區(qū)的基因片段。2.基因片段插入含有人IgG重輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體。第17頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月人鼠嵌合抗體的真核表達(dá)在CHO細(xì)胞（共轉(zhuǎn)染模式和單載體轉(zhuǎn)染模式）

第18頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月Until2003,7，8437peoplehavebeeninfectedwithSARSoverthe32countries,inwhich813patientswerediedformdisease.Thediseaseincidenceisabout10.5%.Therearemanyunresolvedquestionsaboutdiseasepathogenesis,treatmentanddiagnosis.第19頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月2.humanizedantibodies"Humanization"or"reshaping"ofmurineantibodiesisanattempttotransferthefullantigenspecificityandbindingavidityofmurinemonoclonalantibodiestoahumanantibodybygraftingthemurinecomplementaritydeterminingregions(CDRs)ontoahumanvariableregionframework。保留鼠CDR的人源化Ab65to90%第20頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月MouseHumanHumanisedhypervariableframework第21頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月humanization-CDRgrafting

CDRresiduesfromvariableregionofamousemAbaretransferredtohumanantibodyframeworksthathavehighsequencehomologywiththemousecounterparts第22頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月HumanizedAntibodiesAllowsspecificityAllowseffectorfunctionsLessimmunogenic第23頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月humanization-advantageMurinemAbshavebeenextensivelycharacterizedandhavedesirableantiviralpropertiesand/orsuperiorfullyhumanmAbsarehardtoobtain.Thisviableapproachistheclassicandsimpleststrategy

ofhumanizationamongmanyotheravailablestrategies,suchasgraftingspecificitydeterminingresidues17.ThefactthatnearlyhalfofallUSFoodandDrugAdministration

(FDA)-approvedtherapeuticmAbsarehumanizedantibodiestestifiestotheirsafetyandtolerancebyhumans.第24頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月3。FullyhumanmAbs

1）。transgenicmice2）。Humanantibody-displaylibraries3）。TomakeHumanmAbfromhumanbeing全人抗體100%第25頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月1）Transgenicmice首先把小鼠編碼Ig重輕鏈的基因剔除。制備表達(dá)人的Ig重輕鏈的轉(zhuǎn)基因小鼠。上二種小鼠回交，獲得只表達(dá)人Ig重輕鏈的基因的小鼠。當(dāng)用抗原免疫后，小鼠可產(chǎn)生完全人源抗體。第26頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月CreationofFullyHumanmAbsFromTransgenicMiceReplacemurineimmunoglobulin(Ig)GgeneswithhumanIgGgenesWeinerLM.JImmunother.2006;29:1-9.YangX-D,etal.CritRevOncolHematol.2001;38:17-23.MousestrainincapableofproducingmouseantibodiesHumanIglociBreedingBreedingMouseembryonicstemcellscontaininghumanantibodygenesMousestrainproducinghumanandmouseantibodiesMouseembryonicstemcellswithinactivatedmouseheavyandlightchainlociMouseIglociMousestrainproducingonlyhumanantibodies第27頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月Transgenicmouse-advantageHavearepertoireoffullyhumanIgG1gaveresearchersanalternativeroutetohumanmAbsthroughactiveimmunization,withouttheprotocolrestrictionsassociatedwithhumanstudies.第28頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月Transgenicmouse-drawbacksAstheimmuneresponseintransgenicmiceissometimeslessrobustthaninstrainsthatareusedtogeneratemousemAbs,moreimmunizationsorantibodyscreensareoften

required.Thesetransgenicmicecannotexactlyreproducethehumanantibodyresponsebecauseofrepertoiredifferencesandbecausethegeneticbackgroundofthemurinehostaffectsantigenprocessing,B-cellontologyandregulation(e.g.,tolerancemechanisms).Atpresent,thesetransgenicmiceareprotectedintellectualpropertyandthereforenotcommonlyavailable第29頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月2）噬菌體抗體庫技術(shù)

(Phageantibodylibrarytechnique)把人的Ig重輕鏈可變區(qū)基因片段展示在l噬菌體表面,組成抗體庫。通過噬菌體把抗體的表型和基因型相偶聯(lián)，易進(jìn)行分子克隆和基因操作。抗體庫的來源影響篩選結(jié)果（免疫和正常人）。高通量篩選與抗原結(jié)合的抗體，但親和力低。第30頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月scFv---single-chainvariablefragments第31頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月Displaytechnologies-strategy第32頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月PhageDisplayLibrary-Antibodylibrary-fromImmunologyToday(2000),21,371-378第33頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月FlowchartofPhageDisplayApplicationDisplayingTargetsonFilamentousPhagePanning(Selection)ofThePhageLibraryExpressiontheProteinFragmentorIsolationofAffinity-PurifiedPhageClonesLibraryclonesExpressionIsolation第34頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月StartfromhumangenesNewspecificities?Lessimmunogenic?CanscreenalargerrepertoireLossofcombinatorialspecificitiesBypassimmunisation–naivelibraryLowaffinityAffinitymaturationinvitroExtrasteps,moreimmunogenic?Economicalproductioninbacteria

OnlyfragmentsPhageDisplay-advantages第35頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月PhageDisplay-drawbackUnnaturalpairingsoftheantibodyheavyandlightchaincomponentsThemethodofpresentationofantigenasbaitforpanningmayaffectthenumberanddistributionofavailableneutralizingepitopes.第36頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月Na?veorimmunizedKeypointFunctionalAb第37頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月3）用人的骨髓瘤細(xì)胞直接制備

全人抗體關(guān)鍵點(diǎn)：建立好的人骨髓瘤細(xì)胞。穩(wěn)定性高和融合率高。(Humanantibodies2002,11:85-96)第38頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月MousemyelomaHumanmyelomaDoubleselectingmarkers

G418andHATHumanLNBcells第39頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月BreastcancertissueBreastcancercellsWeworkonHCV/E2mAbandRabbisvirusSproteinbyusingFMP2cells.第40頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月4.B細(xì)胞永生化技術(shù)：用EB病毒將人淋巴細(xì)胞永生化可產(chǎn)生分泌抗體的B細(xì)胞克隆。這一技術(shù)較為成熟，但是存在抗體分泌不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用?；蛑苯臃蛛x分泌抗體的B細(xì)胞,用PCR獲得重輕連,構(gòu)建全人抗體.第41頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月Bcellimmortalization:EBVTransformationEpstein-BarrvirusWhenEBVinfectsB-lymphocytesinvitro,lymphoblastoidcelllineseventuallyemergethatarecapableofindefinitegrowth.Thegrowthtransformationofthesecelllinesistheconsequenceofviralproteinexpression.第42頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月BcellimmortalizationMemoryB-cellsareobtainedfromthebloodofanindividualrecoveringfromavirusinfection.Therebyobviatingtheneedforafusionsteptogeneratehybridcells,asinthehybridomatechnique.第43頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月MemoryB-cellimmortalizationMemoryBcellsisolatedfromPBMCImmortalizedbyEBVinthepresenceofaCpGoligodeoxynucleotideandirradiatedallogeneicPBMCs第44頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月RelatedpaperMemoryB-cellsisolatedfromthebloodofindividualswhohaverecoveredfromSARS-CoVandH5N1avianinfluenzainfectionshavebeenimmortalizedusingthismethodtoproduce

nAbsagainsttheseviruses.Traggiai,E.etal.AnefficientmethodtomakehumanmonoclonalantibodiesfrommemoryBcells:potentneutralizationofSARScoronavirus.

Nat.Med.10,871–875(2004).Simmons,C.P.etal.ProphylacticandtherapeuticefficacyofhumanmonoclonalantibodiesagainstH5N1influenza.PLoSMed.4,178(2007).第45頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月５．SingleBcellRT-PCRNatureBiotechnology,2008,26:886-887.第46頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月thestrategyofsinglecellRT-PCR第47頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月Thetimeframe-onemonth第48頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月各種全人抗體生產(chǎn)技術(shù)比較優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)微生物表面展示技術(shù)很成熟，體外進(jìn)行抗體親和力的完善，抗體的重輕鏈不是天然配對(duì)，沒有在體外還原天然抗體的構(gòu)象轉(zhuǎn)基因小鼠可以產(chǎn)生全人免疫球蛋白庫，不受到人體試驗(yàn)的限制轉(zhuǎn)基因老鼠還是并不能生產(chǎn)精確的全人抗體EBV病毒轉(zhuǎn)化EBV病毒轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的B細(xì)胞雜交瘤用于產(chǎn)生中和抗體，材料來源廣泛B細(xì)胞雜交瘤存在染色體不穩(wěn)定，易丟失的缺陷單個(gè)B細(xì)胞RT-PCR方便，常規(guī)分子克隆實(shí)驗(yàn)條件快速，條件優(yōu)化后僅需要30天高通量，針對(duì)抗原特異抗體庫親和力和特異性：親和力很高，獲得針對(duì)抗原各表位的抗體適用通過疫苗治療的各種疾病慢期炎癥或致死性病原體如HIV，癌癥和自身免疫病方面應(yīng)用受到限制第49頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月Sourceofantibodiesonthemarket

(accordingtoa“marketanalyst”)SourceAntigenicity%HumanMouse+++0%Chimeric+60-70%Humanised->90%Human-100%第50頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)：抗體靶向治療的新思考問題1：在臨床上抗體用量大（幾百毫克到克級(jí)），價(jià)格昂貴。在不發(fā)達(dá)國家難于承受。問題2：由于專利限制，中國難于進(jìn)行metoo藥仿制。解決方案：能否利用中和性抗體的靶向作用，確定抗體作用的靶點(diǎn)位子，用小分子替代，設(shè)計(jì)新藥？第51頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月SinceaneutralizedmAbisvaluableindiseasetreatment,thetechniquesusedhereallowustoidentifycorefunctionalregionsofgivenreceptor/ligand.therefore,thereisapotentialtodesignrationalmimickingmoleculesbasedontheidentifiedregion.DefiningthefunctionalregionofligandorreceptorrecognizedbyneutralizingmAbwillbeessentialinidentifyingnoveldrugtargets.Prospective展望第52頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月抗體藥物發(fā)展現(xiàn)狀FDA已批準(zhǔn)上市的抗體藥物SFDA(中國)已批準(zhǔn)上市及臨床研究的的抗體藥物第53頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第54頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第55頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)：工程抗體的未來發(fā)展與展望1.單克隆抗體的市場需求第56頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月

對(duì)2004—2011年全球治療單抗市場的預(yù)測及分析第57頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月2.抗體藥物的應(yīng)用領(lǐng)域抗器官移植排斥反應(yīng)；腫瘤導(dǎo)向治療；哮喘、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、急性心梗、膿毒癥、多發(fā)性硬化癥及其他自身免疫性疾??；心腦血管疾??；感染性疾??；其他第58頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月四種抗體的臨床應(yīng)用概況第59頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第60頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第61頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第62頁，課件共