人類Kras基因突變檢測(cè)試劑盒說明書

類Ks基變書10年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。人類K-ras基因突變檢測(cè)試劑盒（PCR-熔解曲線法）說明書【產(chǎn)品名稱】通用名：人類K-ras基因突變檢測(cè)試劑盒（PCR-熔解曲線法）英 文 名 ：DiagnostickitforMutationsofHumanK-rasGene(PCR-MeltingCurveAnalysis)【包裝規(guī)格】 20測(cè)試/盒【預(yù)期用途】K-ras基因位于12號(hào)染色體短臂上，是重要的癌基因之一，編碼一種21kD的kras蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，主要包括PI3K/PTEN/AKT和RAF/MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這些轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是當(dāng)前腫瘤靶向藥物研究的熱點(diǎn)，靶向藥物經(jīng)過抑制這些途徑發(fā)生藥理作用K-ras基因第2和13密碼子發(fā)生突變，將導(dǎo)致kras蛋白變異并處于持續(xù)激活狀態(tài)，使藥物失效。。據(jù)中國《腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南》，在一項(xiàng)包含101例肺腺癌亞型細(xì)支氣管肺泡癌患者的回顧性研究中，所有患者均接受厄洛替尼單藥一線治療。K-ras突變者無一例緩解（0/18），而無K-ras突變者則有20例緩解（20/62，32%），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。因此，指南建議，非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌患者20年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。使用靶向藥物前應(yīng)進(jìn)行K-ras基因突變狀態(tài)的檢測(cè)。本試劑盒以人非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌腫瘤組織切片提取的基因組DNA為檢測(cè)樣本，用于檢測(cè)腫瘤組織K-ras基因第12，13密碼子的2種體細(xì)胞突變（表1），提供突變狀態(tài)的定性結(jié)果。為臨床腫瘤靶向藥物的個(gè)體化用藥提供輔助診斷依據(jù)，本品適用于進(jìn)入個(gè)體化靶向治療療程前的患者使用?！緳z驗(yàn)原理】本試劑盒基于實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)，結(jié)合了特異引物、熒光探針和熔解曲線技術(shù)，定性檢測(cè)DNA樣品中K-as基因1213密碼子是否存在突變。用一對(duì)K-ras基因特異引物，該引物可擴(kuò)增12種突變型和野生型的ras目標(biāo)序列，利用標(biāo)記了FAM光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的雙標(biāo)記探針一方面抑制野生型基因的擴(kuò)增，提高突變基因的檢測(cè)靈敏度，另一方面在擴(kuò)增后用熔解曲線法實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)30年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。物的分析，熒光探針在未雜交時(shí)因熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相互接近而被淬滅，不發(fā)熒光，雜交狀態(tài)時(shí)，二者相互離開而產(chǎn)生熒光。該熒光探針分別與突變基因和野生型基因的雜交產(chǎn)物在熔解曲線分析時(shí)，表現(xiàn)為熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖中出現(xiàn)不同位置的峰，熔解峰對(duì)應(yīng)的位置即為熔解溫度（Tm值），因野生峰的位置較突變峰位置大3℃以上而得到區(qū)分，但各種突變峰因Tm值相差較小而不能辨別。本品可穩(wěn)定地檢出野生型10ng/ul基因組背景下1%含量的體細(xì)胞突變，其熔解曲線會(huì)出現(xiàn)雙峰，其中突變峰較野生峰Tm值明顯降低（圖1）?！局饕M成成份】40年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。本試劑盒包含PCR反應(yīng)液I、PCR反應(yīng)液Ⅱ和野生型對(duì)照品等3管試劑。PCR反應(yīng)液I包含相應(yīng)的K-ras基因突變檢測(cè)引物和探針，探針由M熒光指示；PCR反應(yīng)液Ⅱ含有dNTP、Taq酶和MgCl2等。檢測(cè)必須但試劑盒中不包含的組分：1.5ml離心管（用于配制PCR反應(yīng)液和DNA提取）；0.2mlPCR或8聯(lián)R或6孔R(shí)；帶濾塞的吸頭（1ml、200μl和10l）；DNA 提 取 試 劑 盒 ReliaPrep?FFPEgDNAMiniprepSystem（貨號(hào)：A2352）【貯存條件及有效期】置于-20℃條件下儲(chǔ)存，有效期6個(gè)月。4-10℃避光條件下儲(chǔ)存或運(yùn)輸不得超過7天。50年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正?！具m用儀器】適用于ABI7500、inegeneFQD-96A型號(hào)的Real-timePCR擴(kuò)增儀。【樣本要求】1.適用樣本為非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌石蠟包埋病理組織切片，切片厚度10μm，數(shù)量1片，所用切片樣品保存不超過3年。2.由于腫瘤的復(fù)雜性，所采集的臨床樣品往往會(huì)混有正常組織細(xì)胞，石蠟包埋病理切片樣品腫瘤病變細(xì)胞應(yīng)不低于 %，所取部分應(yīng)盡量在蠟塊中部；3.使用商業(yè)化的試劑盒來提取人類基因組DNA，推薦使用Promega公司的ReliaPrep?FFPEgDNAMiniprepSystem（A2352）提取石蠟包埋組織切片樣品，所提DNA需用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，其DNAOD260/OD20的值應(yīng)在1.8~2.0，濃度應(yīng)在3~300ng/l之間，樣本DNA質(zhì)量不合格者不得用于檢測(cè)，建議重新取切片進(jìn)行核酸提取，提取完的DNA建議立即進(jìn)行檢測(cè)，否則請(qǐng)-20℃以下保存，保存時(shí)間不要超過6個(gè)月?！緳z驗(yàn)方法】60年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。一、核酸提?。颖咎幚硎遥┦褂肦eliaPrep?FFPEgDNAMiniprepSystem酸提取，提取步驟如下。1.用礦物油去除石蠟加礦物油500μl到裝有組織切片樣本的1.5ml離心管內(nèi)，80℃孵育1min，振蕩混勻；2.組織樣本裂解，消化組織蛋白質(zhì)1) 離心管內(nèi)加入200μl裂解液，室溫10,000g離心15s,形成水油兩相溶液，下層為水相，上層為油相；2) 向離心管水相加入20μl蛋白酶K,用移液槍吸打混勻；3)56℃孵育1h；4)80℃孵育1h；5)冷卻到室溫，離心15s；3.去除RNA向離心管水相加入10μlRNaseA，吸打混勻。室溫（20-25℃）孵育5min；4.用核酸提取柱提取基因組DNA1)加入220μlBLBuffer到含裂解樣品的離心管中，再加入240μl乙醇（95-100），震蕩混勻，室溫10,000g離心15s，形成水油兩相溶液，下層為水相，上層為油相；2)將結(jié)合柱置于收集管內(nèi)，小心吸取離心管下層水相（包括可能形成的沉淀）轉(zhuǎn)移到結(jié)合柱內(nèi)，蓋上管蓋，將離心管丟棄。70年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。3)收集管室溫10,000g離心30s，棄去管中的濾出液。4)把柱子重新裝入收集管中，加入500μl1 洗滌液至柱內(nèi)，室溫10,000g離心30s，棄去濾出的洗滌液。5)重復(fù)步驟4）再洗滌一次；6)打開結(jié)合柱蓋子，室溫條件下16,000g離心3min以甩干柱內(nèi)殘余的液體；7)把柱子轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的自備1.5ml離心管中，向柱內(nèi)加入50lElutionBuffer，室溫16,000g離心1n洗脫基因組DNA，丟棄提取柱。注意事項(xiàng)：1.操作提取柱和收集管時(shí)應(yīng)戴好一次性手套；2.收集基因組DNA前的16,000g離心3min操作必須開蓋，以除凈乙醇，乙醇?xì)埩暨^量將嚴(yán)重影響基因組的收集質(zhì)量。二、試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備室）將試劑從冰箱取出，室溫融化，混勻，1000rpm快速離心20秒，備用；三、反應(yīng)體系配制（試劑準(zhǔn)備室）1. 根據(jù)檢測(cè)樣本數(shù)計(jì)算所需反應(yīng)數(shù)，如樣本數(shù)為n，則需做n+2個(gè)反應(yīng)（包含一個(gè)陰性對(duì)照反應(yīng)和一個(gè)無模板對(duì)照反應(yīng)）；80年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。2. 根據(jù)表3計(jì)算所需各反應(yīng)液的體積，并配制反應(yīng)體系，反應(yīng)體系混勻后000rpm快速離心30秒，分裝至PCR管中，每管18l；四、加樣（樣本處理室）取2μl提取的樣品DNA入PCR反應(yīng)管，蓋上管蓋，1000rpm離心或輕甩，排除管底氣泡；陰性對(duì)照反應(yīng)所用模板為試劑盒中野生型對(duì)照品，空白對(duì)照反應(yīng)所用模板為超純水（自備）。五、上機(jī)檢測(cè)（擴(kuò)增室）1.將PCR管按順序放入PCR儀，設(shè)置反應(yīng)程序（1）LineGeneFQD-96A熒光定量PCR儀程序設(shè)置90年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。在52℃時(shí)收集熒光，熒光檢測(cè)通道選擇FAM檢測(cè)通道，獲得擴(kuò)增曲線及Ct值，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。Melt分析時(shí)，目標(biāo)溫度65℃，起始溫度39℃，臺(tái)階溫度1℃，臺(tái)階溫度維持30s，熒光采集方式為“臺(tái)階”。熒光檢測(cè)通道選擇FAM檢測(cè)通道。（）ABI7500熒光定量PCR儀Melt分析時(shí)，選擇StepAndHold模式，溫度39～65℃，每個(gè)100年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。步驟升高0.3℃，在每個(gè)溫度都收集熒光。熒光檢測(cè)通道選擇FAM檢測(cè)通道。2. 運(yùn)行PCR反應(yīng)程序，保存文件。六、結(jié)果獲取熒光定量PCR儀運(yùn)行結(jié)束后，使用配套軟件對(duì)本次試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖（-dF/dT）分析?！緟⒖寂R界值】以野生型對(duì)照品反應(yīng)管為參照，以野生型對(duì)照峰峰高的1/5劃定閾值線。【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】1.空白對(duì)照在LinegeneFQD-96A中應(yīng)無明顯熔解峰，若分析后出現(xiàn)明顯熔解峰，可能為試劑受到污染或操作過程中的污染，請(qǐng)排除污染源后重新檢測(cè)；在ABI7500中，空白對(duì)照熒光變化曲線（NormalizedReporter）應(yīng)為逐漸上升的一條斜線（如圖4），若出現(xiàn)熒光值下降的熔解特征曲線，可能為試劑受到污染或操作過程中的污染，請(qǐng)排除污染源后重新檢測(cè)；2.野生型對(duì)照管在熔解曲線分析后應(yīng)有單獨(dú)熔解峰，若野生型對(duì)照管無熔解峰，或出現(xiàn)2或2個(gè)以上熔解峰，該批次樣本需重新檢測(cè)。請(qǐng)確認(rèn)所使用的試劑是否仍在有效期內(nèi)，確定操作是110年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。否嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。3.若滿足1和2要求，表明此次實(shí)驗(yàn)成功，對(duì)樣品管進(jìn)行分析：（1）樣品管只出現(xiàn)單獨(dú)熔解峰，且Tm值在野生型對(duì)照管熔解曲線峰Tm±1范圍內(nèi)，該樣本判定為陰性（野生型），如圖5野生峰；（2）樣品管只出現(xiàn)單獨(dú)熔解峰，且Tm值小于野生型對(duì)照管熔解曲線峰Tm值3℃以上，則該樣本判定為陽性（突變型），如圖5突變峰；（3）樣品管出現(xiàn)兩個(gè)熔解峰，且兩個(gè)熔解峰分別符合（1）和（2）的要求（如圖6A），或樣品管出現(xiàn)一個(gè)寬峰（左右各有一個(gè)高點(diǎn)，能夠判為峰值，但兩峰間平緩過渡，凹陷不明顯，見圖6B、C和D），則該樣本判定為陽性（突變型）；（4）一般情況下不會(huì)出現(xiàn)突變峰與野生峰位置相差3℃以內(nèi)或單一突變峰與野生型對(duì)照管的野生峰位置相差1~3℃的情況，如確實(shí)發(fā)生此種情況，考慮儀器溫度控制和傳感系統(tǒng)是否發(fā)生故障；（5）樣品管在熔解曲線分析中無明顯熔解曲線峰，可能為DNA樣本中存在PCR抑制劑或DNA量不120年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。夠，請(qǐng)確認(rèn)樣本質(zhì)量以及前處理過程是否規(guī)范，必要時(shí)再行檢測(cè)?！緳z驗(yàn)方法的局限性】本試劑盒僅適用于規(guī)定的儀器和檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)結(jié)果130年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。僅供臨床參考，不得作為臨床診治的唯一依據(jù)?！井a(chǎn)品性能指標(biāo)】1.本試劑盒能檢出在野生型背景下1%的Kras基因12、13密碼子各種突變，經(jīng)1050例非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌腫瘤組織樣本臨床試驗(yàn)，本品與測(cè)序法作對(duì)照，陽性符合率為99.1%，陰性符合率為95.7%，總符合率為97.2%。2.試劑盒應(yīng)外觀清潔、無泄漏、無破損，標(biāo)志、標(biāo)簽字跡清楚；各組分融化后應(yīng)澄清透明，無色，無沉淀。3.檢測(cè)分別12份陽性參考品，陽性參考品符合率應(yīng)為100%。4.檢測(cè)10份陰性參考品，陰性參考品符合率應(yīng)為100%。5.能夠檢出10ng野生型基因組DNA背景下，含量低至1%的K-ras基因突變。6.用2份企業(yè)內(nèi)部精密性參考品分別作10次平行檢測(cè)，結(jié)果均為陽性且Ct值變異系數(shù)CV≤8%或Tm值極差≤1℃?！咀⒁馐马?xiàng)】1.本試劑盒僅用于體外研究。實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書。140年4月9日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。2.PCR檢測(cè)應(yīng)在有資質(zhì)的臨床PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照衛(wèi)生部《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔〕194號(hào)文件規(guī)定進(jìn)行資質(zhì)認(rèn)定和管理。3.實(shí)驗(yàn)過程中必須使用專用的移液槍和一次性帶濾塞的加