生物工程下游分離與純化課件

生物工程下游分離與純化生物工程下游分離與純化讓我們從兩個(gè)實(shí)例說(shuō)起實(shí)例一紫杉醇白色結(jié)晶體粉末。無(wú)臭，無(wú)味。水難溶，溶于氯仿、丙酮。紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對(duì)肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。1963年美國(guó)化學(xué)家瓦尼從美國(guó)西部大森林太平洋杉（PacificYew）也叫短葉紅豆杉樹皮和木材分離得到。從紅豆杉中如何獲得的呢？樹皮粉碎85-95%酒精35-55℃熱回流浸提三次50-70℃真空減壓濃縮氯仿萃取得1%氯仿膏氯仿完全溶解硅膠攪拌均勻干燥過(guò)篩裝層析柱氯仿-甲醇梯度洗脫濃縮得5～8%半成品丙酮溶解硅膠攪拌均勻干燥過(guò)篩裝層析柱丙酮－石油醚梯度洗脫濃縮得20～25%半成品丙酮-石油醚結(jié)晶3～4次抽濾50℃真空減壓干燥得75～80%半成品16Mpa壓力層析分離濃縮丙酮－石油醚結(jié)晶抽濾干燥，得99．5%成品。嚴(yán)謹(jǐn)而復(fù)雜的分離純化過(guò)程！讓我們從兩個(gè)實(shí)例說(shuō)起實(shí)例一紫杉醇白色結(jié)晶體粉末。無(wú)臭，無(wú)味從杉樹中提取，破壞環(huán)境、破壞植物多樣性、各國(guó)明令禁止！發(fā)酵培養(yǎng)1個(gè)月20-25℃紫杉醇發(fā)酵液預(yù)處理過(guò)濾濾液萃取收集有機(jī)物或納濾濃縮45℃減壓蒸發(fā)紫杉醇粗提物大孔吸附樹脂脫色提取80%乙腈洗脫硅膠柱層析（去除酯、蠟等雜質(zhì)）高純度紫杉醇正己烷結(jié)晶真空干燥40℃紫杉醇晶體等體積萃取液

氯仿：甲醇=10:1內(nèi)生真菌冷凍離心3min8-12h嚴(yán)謹(jǐn)而復(fù)雜的分離純化過(guò)程！從杉樹中提取，破壞環(huán)境、破壞植物多樣性、各國(guó)明令禁止！發(fā)酵培實(shí)例二血液透析是急慢性腎功能衰竭患者腎臟替代治療方式之一。它通過(guò)將體內(nèi)血液引流至體外，經(jīng)一個(gè)由無(wú)數(shù)根空心纖維組成的透析器中，血液與含機(jī)體濃度相似的電解質(zhì)溶液（透析液）在一根根空心纖維內(nèi)外，通過(guò)彌散/對(duì)流進(jìn)行物質(zhì)交換，清除體內(nèi)的代謝廢物、維持電解質(zhì)和酸堿平衡；同時(shí)清除體內(nèi)過(guò)多的水分，并將經(jīng)過(guò)凈化的血液回輸?shù)恼麄€(gè)過(guò)程稱為血液透析。實(shí)例二血液透析是急慢性腎功能衰竭患者腎臟替嚴(yán)謹(jǐn)而復(fù)雜的清除代謝廢物過(guò)程！嚴(yán)謹(jǐn)而復(fù)雜的清除代謝廢物過(guò)程！生物工程下游分離與純化課件從以上兩個(gè)實(shí)例：從復(fù)雜的體系中分離純化出目的產(chǎn)物或者分離清除出代謝廢物的過(guò)程至關(guān)重要！生物技術(shù)專業(yè)還開設(shè)一門課稱為《生物過(guò)程下游工藝》從以上兩個(gè)實(shí)例：從復(fù)雜的體系中分離純化出目的生物制品生產(chǎn)過(guò)程示意圖本課程解決的問題-下游技術(shù)上游過(guò)程中游技術(shù)生物制品生產(chǎn)過(guò)程示意圖本課程解決的問題-下游技術(shù)上游過(guò)程中游發(fā)酵液/天然動(dòng)/植物預(yù)處理固液分離細(xì)胞破碎細(xì)胞碎片分離胞外產(chǎn)物初步純化高度純化產(chǎn)品及包裝加工均質(zhì)超聲研磨溶胞沉降過(guò)濾離心粉碎/加熱溶解/調(diào)pH絮凝或凝聚再凝聚等離心分離萃取過(guò)濾沉淀吸附萃取膜過(guò)濾吸附色譜分配色譜離子交換凝膠色譜親和色譜液相色譜無(wú)菌過(guò)濾超濾冷凍干燥真空干燥噴霧干燥結(jié)晶生物分離的一般過(guò)程發(fā)酵液/天預(yù)處理固液分離細(xì)胞破碎細(xì)胞碎胞外產(chǎn)物初步純化高度純What?課程基本內(nèi)容1.生物工程下游技術(shù)的特點(diǎn)和一般流程2.生物樣品的預(yù)處理

（凝聚、絮凝、沉降、過(guò)濾、離心）3.膜分離技術(shù)

(微濾、超濾、納濾、反滲透、電滲析、透析等）

4.色譜分離技術(shù)（吸附/分配/離子交換/凝膠/親和）

5.離子交換與吸附（陽(yáng)離子交換、陰離子交換、吸附分離）6.萃取技術(shù)（溶劑/雙水相/超臨界）

7.電泳技術(shù)（等電聚焦/毛細(xì)管電泳/制備電泳）8.生物樣品的精制——濃縮結(jié)晶干燥

What?課程基本內(nèi)容1.生物工程下游技術(shù)的特點(diǎn)和一般流生物工程產(chǎn)品的特點(diǎn)

①產(chǎn)物在初始物料中的含量低（氧傳遞限制；細(xì)胞量；產(chǎn)物抑制）②初始原料的組成成分復(fù)雜（

大分子;小分子;可溶物;不可溶物;化學(xué)添加物）；③產(chǎn)品中有時(shí)含有微生物的細(xì)胞、代謝產(chǎn)物、殘留培養(yǎng)基；④生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性差（對(duì)pH、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、表面張力等都十分敏感，易失活變性）；⑤生物發(fā)酵產(chǎn)品種類繁多，產(chǎn)物的分子量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等往往差異很大；⑥質(zhì)量要求高(許多產(chǎn)品用作醫(yī)藥、食品、試劑等)。生物工程產(chǎn)品的特點(diǎn)

①產(chǎn)物在初始物料中的含量低（氧傳遞限生物工程下游分離過(guò)程的特點(diǎn)↗滿足維持生物物質(zhì)活性的要求↗滿足快速分離的要求↗滿足純度和雜質(zhì)去除的要求↗滿足高效分離的要求↗滿足成本優(yōu)化的要求生物工程下游分離過(guò)程的特點(diǎn)生物分離的經(jīng)濟(jì)性(1)生物分離至少占總成本50%(2)降低廢物排放（有時(shí)甚至產(chǎn)品：廢物=1:3250)

(3)工藝改造分離工程研發(fā)費(fèi)用與成本研究費(fèi)用：50%以上產(chǎn)品成本：40-80%人力物力：70-90%因此，生物工程下游技術(shù)不可忽視！生物分離的經(jīng)濟(jì)性(1)生物分離至少占總成本50%生物分離純化需滿足的要求——具體化①操作條件必須溫和，特別是對(duì)具有生物活性的物質(zhì)，在后處理過(guò)程中必須保持其生物活性；②分離純化技術(shù)的選擇性和專一性強(qiáng)，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來(lái)，達(dá)到較高的分離純化倍數(shù)；③目的產(chǎn)物的量和活性具有較高的收率；④在提高單個(gè)分離技術(shù)效率的同時(shí)，注意各單元操作間的整體協(xié)調(diào)，工藝步驟盡可能的少；⑤整個(gè)過(guò)程快速。生物分離純化需滿足的要求——具體化分離純化路線包括兩個(gè)基本階段①產(chǎn)物的初級(jí)分離階段★初級(jí)分離階段在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束之后，主要是分離細(xì)胞和培養(yǎng)液、破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物（如胞內(nèi)酶），溶解包涵體，復(fù)原蛋白質(zhì)，濃縮產(chǎn)物和去除大部分雜質(zhì)等。②產(chǎn)物的純化精制階段★純化精制階段是在初級(jí)分離的基礎(chǔ)上，用各種高選擇性的技術(shù)手段，將目的產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡可能地分開，使產(chǎn)物的純度達(dá)到相關(guān)的要求。分離純化路線包括兩個(gè)基本階段①產(chǎn)物的初級(jí)分離階段②產(chǎn)物的活性物質(zhì)分離純化工藝選擇原則質(zhì)量原則：保證產(chǎn)品的高質(zhì)量，一是所選擇的分離純化方法要有利于最大程度的去除雜質(zhì)。二是在分離純化過(guò)程中要防止生物活性物質(zhì)的降解失活。收率原則：工藝條件優(yōu)化時(shí)，必須考慮收率的最大化。收率與純度是一對(duì)矛盾體，通過(guò)工藝優(yōu)化研究可以使收率與純度都達(dá)到最佳值。時(shí)間原則：一是掌握生物活性物質(zhì)穩(wěn)定性的時(shí)間；二是工藝路線設(shè)計(jì)時(shí)各單元操作所需時(shí)間的匹配，盡量節(jié)省時(shí)間。活性物質(zhì)分離純化工藝選擇原則生物分離純化的基本策略下游分離純化工作前的準(zhǔn)備：全面的調(diào)查分析，充分地論證；準(zhǔn)備充足的實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)設(shè)備提取工藝：盡可能選擇簡(jiǎn)單的提取工藝分離純化步驟：①原材料的預(yù)處理②顆粒性雜質(zhì)的去除——固液分離（離心法、過(guò)濾法）③可溶性雜質(zhì)的去除和目標(biāo)產(chǎn)物的初步純化（選擇性沉淀、膜過(guò)濾、選擇性吸附以及萃取等技術(shù)，去除與目標(biāo)產(chǎn)物混溶的可溶性雜質(zhì)；必要時(shí)采用集成分離技術(shù)）④目標(biāo)產(chǎn)物的精制（如：層析法和電泳法）工藝放大策略：小試－中試－大規(guī)模生產(chǎn)生物分離純化的基本策略下游分離純化工作前的準(zhǔn)備：全面的調(diào)查分生物分離技術(shù)與化工分離技術(shù)的區(qū)別

?化工分離技術(shù)：

獲得純的化學(xué)物質(zhì)?生物分離技術(shù)：在得到純的生物物質(zhì)同時(shí)，還必須關(guān)注特定雜質(zhì)的去除；同時(shí)保持其生物活性與傳統(tǒng)的化學(xué)試劑的純度概念不同，生物產(chǎn)物對(duì)有害物質(zhì)有嚴(yán)格的控制，生產(chǎn)過(guò)程也要求有嚴(yán)格的管理，在最終產(chǎn)品中往往不允許有極微量的有害雜質(zhì)存在。生物分離技術(shù)與化工分離技術(shù)的區(qū)別

?化工分離技術(shù)：生物分離與純化技術(shù)的發(fā)展前景——技術(shù)應(yīng)用

生物產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)最終歸結(jié)為低成本和高純度因此，簡(jiǎn)化工藝、降低成本和提高質(zhì)量是生物分離與純化技術(shù)的發(fā)展方向。1.研究和開發(fā)新型和經(jīng)濟(jì)高效的分離純化技術(shù)(1)新型分離介質(zhì)的研制——色譜分離介質(zhì)(2)膜分離技術(shù)的推廣應(yīng)用(3)提高分離過(guò)程的選擇性：應(yīng)用分子識(shí)別原理，利用生物親和作用的高度特異性，結(jié)合已有分離技術(shù)：親和層析、親和膜分離、雙水相萃取、反膠團(tuán)萃取、親和沉淀、親和色譜、親和電泳等(4)強(qiáng)化分離過(guò)程的研究——機(jī)理研究：綜合運(yùn)用化學(xué)、工程、生物、數(shù)學(xué)、計(jì)算等多學(xué)科知識(shí)和工具，學(xué)科交叉，實(shí)現(xiàn)新突破2.生物工程上游技術(shù)與下游技術(shù)相結(jié)合3.通過(guò)上游工藝條件優(yōu)化，減少非目的產(chǎn)物——eg.半透膜發(fā)酵罐；發(fā)酵罐中加入吸附樹脂總之：進(jìn)一步研究和開發(fā)高效、低成本的分離與純化技術(shù)必將推動(dòng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展生物分離與純化技術(shù)的發(fā)展前景——技術(shù)應(yīng)用

生物產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)

細(xì)胞破碎技術(shù)20研磨細(xì)胞破碎技術(shù)20研磨21

機(jī)械法與非機(jī)械法比較21機(jī)械法與非機(jī)械法比較例3.超濾膜分離原理示意圖（2）依據(jù)被分離物質(zhì)的體積大小及與膜的親和性而得到分離例3.超濾膜分離原理示意圖（2）依據(jù)被分離物質(zhì)的體積大中空纖維超濾膜組件中空纖維UF膜特點(diǎn)

◎清洗性好◎均勻微孔分布

◎纖維內(nèi)徑多種規(guī)格

◎膜內(nèi)部阻力小中空纖維超濾膜組件中空纖維UF膜特點(diǎn)卷式反滲透膜組件及不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)膜組件不對(duì)稱膜卷式反滲透膜組件及不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)膜組件不對(duì)稱膜膜分離壓力膜分離壓力膜分離技術(shù)應(yīng)用舉例膜分離技術(shù)應(yīng)用舉例膜分離過(guò)程在生物工程中的應(yīng)用膜分離過(guò)程在生物工程中的應(yīng)用電滲析分離電滲析分離

透析（Dialysis,D)

依濃度差傳遞低分子量溶質(zhì)，截留高分子量溶質(zhì)的過(guò)程。透析（Dialysis,D)

依濃度差傳遞低分子量溶質(zhì)，親和膜分離操作方式1.親和超濾過(guò)程（分離目標(biāo)物的同時(shí)，濃縮其他成分）

膜孔小2.微孔親和過(guò)濾過(guò)程（僅分離目標(biāo)物）親和膜分離操作方式1.親和超濾過(guò)程（分離目標(biāo)物的同時(shí)，濃縮例1.凝膠滲透色譜的分離原理

依據(jù)被分離物質(zhì)體積大小不同而分離例1.凝膠滲透色譜的分離原理依據(jù)被分離物質(zhì)體積大例2.離子交換色譜的分離過(guò)程

利用被分離物質(zhì)與離子交換樹脂的親和性不同而得到分離例2.離子交換色譜的分離過(guò)程利用被分離物質(zhì)與離子交換萃取技術(shù)萃取技術(shù)色譜分離法色譜分離法色譜系統(tǒng)的基本組成⑴泵⑵混合器⑶層析柱⑷檢測(cè)器⑸記錄儀⑹分部收集器檢測(cè)器：吸光度、熒光、折射率、化學(xué)發(fā)光、電導(dǎo)率等色譜系統(tǒng)的基本組成⑴泵檢測(cè)器：吸光度、熒光、折射率、化學(xué)發(fā)抗菌素、維生素、氨基酸、酶制劑、酶抑制劑、菌體制劑、免疫活性劑、生物制品、有機(jī)試劑、胞外（內(nèi)）高分子聚合物等等霉菌放線菌

短桿菌桿菌

球菌

利用微生物作為菌種發(fā)酵生產(chǎn)有用物質(zhì)抗菌素、維生素、氨基酸、酶制劑、酶抑制劑、菌體制劑、免疫活性實(shí)例1：聚谷氨酸的分離純化γ-聚谷氨酸（γ-PGA）結(jié)構(gòu)：D-/L-谷氨酸，γ-酰胺鍵，1-100萬(wàn)性質(zhì)：水溶性、生物相容性、生物可降解性、可食用性、對(duì)人類和環(huán)境無(wú)毒無(wú)害實(shí)例1：聚谷氨酸的分離純化γ-聚谷氨酸（γ-PGA）PGA應(yīng)用領(lǐng)域藥物緩釋保水劑吸水劑保濕劑增稠劑絮凝劑γ-PGA醫(yī)藥農(nóng)業(yè)環(huán)境食品化妝品其他PGA應(yīng)用領(lǐng)域藥物緩釋保水劑吸水劑保濕劑增稠劑絮凝劑γ-PG微濾：右側(cè)為外壓式中空纖維濾膜，孔徑為0.2μm，用于除去發(fā)酵液中的菌體。超濾：左側(cè)為內(nèi)壓式中空纖維濾膜，透過(guò)孔徑約為10-100nm。而聚谷氨酸的重均分子量為30萬(wàn)左右，所以通過(guò)超濾可以除去發(fā)酵液中的小分子蛋白和糖類等雜質(zhì)；同時(shí)實(shí)現(xiàn)濃縮。

微濾去除菌體，超濾去除小分子雜質(zhì)發(fā)酵罐微濾膜和超濾膜微濾：右側(cè)為外壓式中空纖維濾膜，孔徑為0.2μm，用于除去發(fā)通過(guò)上一步的濃縮過(guò)濾，發(fā)酵液的體積可以減少數(shù)十倍，此時(shí)加入四倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀得到PGA濃縮液醇沉-離心-透析-冷凍干燥得到產(chǎn)物將沉淀離心，利用透析袋進(jìn)一步除去小分子物質(zhì)，然后進(jìn)行冷凍干燥，得到相對(duì)純凈的產(chǎn)品。濃縮液醇沉-離心-透析-冷凍干燥得到產(chǎn)物將沉淀離心，利用透實(shí)例2-凝膠色譜法分離單壁碳納米管單壁碳納米管（SWCNTs）是由碳原子形成的石墨片層卷成的無(wú)縫、中空的管體，可包含一層到上百層石墨層。是一種具有戰(zhàn)略意義的新興材料，它在復(fù)合材料、平板顯示器、生物傳感器、抗電磁干擾材料等方面有廣闊的應(yīng)用前景。目前分離單壁碳納米管的方法：雙向電泳、超速離心等主要問題:產(chǎn)量低、費(fèi)用高多級(jí)凝膠色譜法：基于SWCNTs不同手性結(jié)構(gòu)組分與烯丙基葡聚糖凝膠之間相互作用強(qiáng)度不同而實(shí)現(xiàn)分離實(shí)例2-凝膠色譜法分離單壁碳納米管單壁碳納米管（SWCNTs預(yù)實(shí)驗(yàn)研究單壁碳納米管與色譜填料的相互作用Figure1|Effectofoverloadingsingle-wallcarbonnanotubes(SWCNTs)ongelcolumns.請(qǐng)看視頻預(yù)實(shí)驗(yàn)研究單壁碳納米管與色譜填料的相互作用Figure1不同加載量的SWCNT原液及色譜分離效果

（視頻說(shuō)明）2根色譜柱，填充相同量（1.4ml）的烯丙基葡聚糖填料，柱1、柱2分別加入1ml和8ml分散于2wt%SDS水溶液的SWCNT原液用2wt%低濃度SDS洗脫非結(jié)合的SWCNT，得到2種不同顏色的色譜柱：柱1上紫下藍(lán)；柱2為均勻紫色。再分別注入高濃度（5wt%）SDS溶液，洗脫掉結(jié)合在色譜填料上的SWCNT，柱1為藍(lán)色；柱2為紫色?？梢姡煌Y(jié)構(gòu)的SWCNT可以選擇性地吸附在該凝膠色譜填料上，并由于相互作用強(qiáng)度的不同而實(shí)現(xiàn)分離。不同加載量的SWCNT原液及色譜分離效果

（視頻說(shuō)明）色譜分離方法與結(jié)果色譜分離方法與結(jié)果多種不同手性結(jié)構(gòu)組分SWCNT分離原理示意圖分離得到的產(chǎn)物多種不同手性結(jié)構(gòu)組分SWCNT分離原理示意圖分離得到的產(chǎn)物得到不同組分的吸收光譜得到的每種組分再重復(fù)進(jìn)行上述凝膠色譜分離過(guò)程，便可得到各種不同手性組分和含量的分級(jí)產(chǎn)物重復(fù)上述凝膠色譜過(guò)程分離得到分級(jí)產(chǎn)物得到不同組分的吸收光譜得到的每種組分再重復(fù)進(jìn)行上述凝膠色譜分凝膠色譜分離單壁碳納米管的優(yōu)點(diǎn)及資料來(lái)源本研究依據(jù)不同組分單壁碳納米管與烯丙基葡聚糖凝膠介質(zhì)之間的相互作用強(qiáng)度不同，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物多組分的分離該方法簡(jiǎn)單、快速、成本低，易于實(shí)現(xiàn)單壁碳納米管的大規(guī)模分離.Ref.Large-scalesingle-chiralityseparationofsingle-wallcarbonnanotubesbysimplegelchromatography.

NatureCommunications.2011.5.1-8技術(shù)來(lái)源于日本筑波先進(jìn)工業(yè)科學(xué)與技術(shù)國(guó)家研究所

（NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology,Tsukuba,Japan.）凝膠色譜分離單壁碳納米管的優(yōu)點(diǎn)及資料來(lái)源本研究依據(jù)不同組分單實(shí)例3.反膠束萃取技術(shù)分離純化漆酶實(shí)例3.反膠束萃取技術(shù)分離純化漆酶WhatIsReverseMicelles?反相乳液生物來(lái)源，生物相容性，無(wú)毒無(wú)害WhatIsReverseMicelles?反相WhatIsRL-basedRME?Rhamnolipid-basedReverseMicelleExtractionWhatIsRL-basedRME?RhamnoSDSAnalysis1CrudeExtract1232AfterRME3MarkerSDSAnalysis1CrudeExTheReuseofReversedMicellarSystem該反膠束萃取體系還能反復(fù)利用，既減少環(huán)境污染，又節(jié)省成本。AO