MLST方法原理、數(shù)據(jù)處理及應(yīng)用介紹課件

MLST方法原理及應(yīng)用介紹中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室周海健MLST方法原理及應(yīng)用介紹中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制1分型方法分辨力分型力可重復(fù)性可比性操作難易程度一次實(shí)驗(yàn)周期實(shí)驗(yàn)通量實(shí)驗(yàn)費(fèi)用*核糖體分型（Ribotyping）好好好中等一般一天小低隨機(jī)擴(kuò)增PCR（RAPD）一般好一般中等容易一天大低擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）較好較好好中等一般兩天中等中等多位點(diǎn)序列分型（MLST）一般好好好一般>兩天大高脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）較好較好較好較好一般兩天小中等多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列（MLVA）較好較好較好較好一般一天大低常用細(xì)菌分子分型方法的比較

分型方法分辨力分型力可重復(fù)2分子分型主要的三種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)形式1.圖像數(shù)據(jù)：

脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析（RAPD)擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析（AFLP）核糖體分型（Ribotyping）2.分類數(shù)據(jù)：

多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（MLVA）多位點(diǎn)序列分析（MLST）單堿基核苷酸多態(tài)性分析（SNP）3.序列數(shù)據(jù)：全基因測(cè)序特異基因、基因簇測(cè)序（如軍團(tuán)菌的mip基因測(cè)序、腦膜炎奈瑟菌的PorA和FetA分型、16srRNA基因測(cè)序）分子分型主要的三種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)形式1.圖像數(shù)據(jù)：3分型的三個(gè)層次相似度比較（Pairwisesimilarities）種群結(jié)構(gòu)分析（Populationmodelling）遺傳進(jìn)化關(guān)系分析（Evolutionarymodelling）分型的三個(gè)層次相似度比較（Pairwisesimilari4PFGE:引起兩株細(xì)菌分型數(shù)據(jù)不同的遺產(chǎn)事件MLVA：VNTR位點(diǎn)滑鏈突變MLST：管家基因的點(diǎn)突變大片段的插入、缺失、重組等酶切位點(diǎn)的點(diǎn)突變質(zhì)粒的獲得、丟失PFGE:引起兩株細(xì)菌分型數(shù)據(jù)不同的遺產(chǎn)事件MLVA：VNT5MLST基本原理菌株編號(hào)abcZadkaroEfumCgdhpdhCpgmMLST型NM20110111213219ST-7NM2011022343846ST-11NM2011032343846ST-11NM201104222358275305255ST-4821細(xì)菌染色體abcZ

測(cè)序結(jié)果123222222222MLST基本原理菌株編號(hào)abcZadkaroEfumCgdh6DNA提取管家基因擴(kuò)增分離鑒定標(biāo)本采集可靠的序列MLST分型流程序列分析純菌培養(yǎng)測(cè)序構(gòu)樹(shù)DNA提取管家基因擴(kuò)增分離鑒定標(biāo)本采集可靠的序列MLST分型7（1）已分離到細(xì)菌：細(xì)菌培養(yǎng)，提取DNA。用試劑盒或者水煮法提取均可以。（2）未分離到細(xì)菌的標(biāo)本（腦脊液、血液、咽拭子、肺泡灌洗液等）：用標(biāo)本直接提取細(xì)菌DNA，只能用試劑盒提取。DNA提取（1）已分離到細(xì)菌：細(xì)菌培養(yǎng)，提取DNA。用試劑盒或者水煮法8/neisseria腦膜炎奈瑟菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)/流感嗜血桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù).uk/legionella/legionella_sbt/php/sbt_homepage.php嗜肺軍團(tuán)菌SBT（MLST）分型數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站提交獲得分型結(jié)果http://mlst.ucc.ie/沙門(mén)氏菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)/neisseriaht9MLST結(jié)果MLST適合用于長(zhǎng)期的、大范圍的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)菌群結(jié)構(gòu)變化，研究地域性傳播和流行性變遷。管家基因序列的變化速率慢，多態(tài)性相對(duì)于其他基因組分更小，目前認(rèn)為MLST不能單獨(dú)作為暴發(fā)溯源的工具。兩株細(xì)菌MLST分型結(jié)果相同，表示這兩株細(xì)菌屬于相同的克隆或者克隆群，不能認(rèn)為他們之間有流行病學(xué)聯(lián)系。MLST結(jié)果MLST適合用于長(zhǎng)期的、大范圍的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)102005-2012年234株腦膜炎奈瑟菌MLST分析MLST應(yīng)用實(shí)例一：腦膜炎奈瑟菌種群結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀分析2005-2012年234株腦膜炎奈瑟菌MLST分析MLST111956-2012年流腦主要血清群流行菌株分子型別變遷MLST應(yīng)用實(shí)例二：腦膜炎奈瑟菌菌群變遷1956-2012年流腦主要血清群流行菌株分子型別變遷MLS12MLST應(yīng)用實(shí)例三：環(huán)境軍團(tuán)菌菌群結(jié)構(gòu)分析2005-2012年中國(guó)7個(gè)城市環(huán)境分離164株血清1型嗜肺軍團(tuán)菌種群結(jié)構(gòu)特征MLST應(yīng)用實(shí)例三：環(huán)境軍團(tuán)菌菌群結(jié)構(gòu)分析2005-201213中、日、韓三國(guó)環(huán)境分離血清1型嗜肺軍團(tuán)菌種群結(jié)構(gòu)特征中、日、韓三國(guó)環(huán)境分離血清1型嗜肺軍團(tuán)菌種群結(jié)構(gòu)特征14MLST應(yīng)用實(shí)例四：霍亂弧菌菌群結(jié)構(gòu)特征分析160株O1群霍亂弧菌MLST分析最小生成樹(shù)160株O1群霍亂弧菌MLST分析Neighbor-joining樹(shù)MLST應(yīng)用實(shí)例四：霍亂弧菌菌群結(jié)構(gòu)特征分析160株O1群霍15MLST應(yīng)用實(shí)例五：副溶血弧菌菌群結(jié)構(gòu)特征分析MLST應(yīng)用實(shí)例五：副溶血弧菌菌群結(jié)構(gòu)特征分析16謝謝謝謝17無(wú)法區(qū)分：分離株有相同的帶型，包括條帶的數(shù)目和位置。這些分離株為同一菌株。高度相關(guān)：如果PFGE帶型僅有因一次基因事件引起的帶型變化，這些菌株就被定義為高度相關(guān)菌株。這些僅有兩到三個(gè)條帶變化的情況常見(jiàn)于反復(fù)傳代以及從同一病人中多次分離的菌株?？赡芟嚓P(guān)：PFGE帶型與爆發(fā)菌株帶型變化有兩個(gè)獨(dú)立的基因事件引起的條帶變化。（通常是4到6個(gè)條帶的變化）。這些分離株可能是遺傳上相關(guān)的，但是并不是緊密相關(guān)的，其流行病學(xué)關(guān)系也并不緊密。這樣的突變常見(jiàn)于分離自較長(zhǎng)的時(shí)間段（大于等于6個(gè)月）或者是大規(guī)模延伸爆發(fā)的病人中。無(wú)關(guān)：三個(gè)獨(dú)立的基因事件引起的條帶變化（7個(gè)或者是以上的條帶變化）。PFGE結(jié)果判讀：TENOVER原則TENOVER原則的前提：菌株是同一暴發(fā)期間分離的無(wú)法區(qū)分：分離株有相同的帶型，包括條帶的數(shù)目和位置。這些分離18關(guān)于分型方法使用的建議暴發(fā)調(diào)查所有菌株進(jìn)行PFGE，挑選代表菌株進(jìn)行MLST；對(duì)于細(xì)菌特異性引物PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本未能分離菌株的，進(jìn)行MLST分型。個(gè)案調(diào)查所有菌株進(jìn)行PFGE和MLST分型；對(duì)于細(xì)菌特異性引物PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本未能分離菌株的，進(jìn)行MLST分型。全國(guó)范圍的、長(zhǎng)期的流行情況調(diào)查所有菌株進(jìn)行PFGE，挑選代表菌株進(jìn)行MLST分型。關(guān)于分型方法使用的建議暴發(fā)調(diào)