PCR擴增實驗操作步驟

PCR擴增實驗操作步驟PCR擴增反應(yīng)PCR是一種選擇性擴增DNA或RNA的方法。其基本原理是依據(jù)體內(nèi)細(xì)胞分裂中的DNA半保留復(fù)制機理，以及在體外dNTP分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)。通過人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈DNA，單鏈DNA與人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高溫的DNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNA。PCR反應(yīng)分為三步：變性、退火和延伸。在變性步驟中，通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA；在退火步驟中，當(dāng)溫度突然降低時，由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜得多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機會較少；在延伸步驟中，在DNA聚合酶和4種dNTP底物及Mg2+存在的條件下，5'→3'的聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應(yīng)。以上三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板，數(shù)小時之后，介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到了大量復(fù)制，數(shù)量可達2×106~7拷貝。實驗材料包括細(xì)菌DNA模板、TsgDNA聚合酶、dNTP混合液、10倍濃度PCR緩沖液、RAPD引物（S14、S15、S18、S66、S74、S88、S97、S103、S110和S115）和提取細(xì)菌DNA的相關(guān)試劑。操作步驟包括細(xì)菌染色體DNA的提取和RAPD反應(yīng)體系的配置，將RAPD反應(yīng)試劑加入EP管中，輕混后用100ul石蠟油覆蓋于反應(yīng)混合液之上，防止樣品在反復(fù)加熱-冷卻的過程中蒸發(fā)，蓋好蓋子。打開PCR反應(yīng)儀，設(shè)置反應(yīng)程序，將EP管放入儀器開始擴增，循環(huán)35次；72攝氏度延伸10分鐘。儀器型號為ModelMyGene25Plus。在進行PCR反應(yīng)時，需要嚴(yán)格控制DNA樣品及各種試劑的用量，確保吸樣量的準(zhǔn)確性并將其全部放入反應(yīng)體系中。為了避免污染，所有用于PCR反應(yīng)的Tip尖、離心管和蒸餾水都應(yīng)進行滅菌處理。同時，在吸取每種試劑時都需要更換新的滅菌Tip尖。在加試劑時，需要先加消毒三蒸水，最后再加入DNA模板和TaqDNA聚合酶。在置入PCR儀進行PCR反應(yīng)前，需要確保PCR管蓋緊，以避免液體蒸發(fā)影響PCR反應(yīng)的效果。在選擇引物時，首先需要確保引物與模板的序列緊密互補。其次，需要避免引