GB-T 42702-2023 紙、紙板和紙制品 抗菌性能的測(cè)定

GB/T42702—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)提出。本文件由全國造紙工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC141)歸口。本文件起草單位：中輕(晉江)衛(wèi)生用品研究有限公司、中國制漿造紙研究院有限公司、中輕紙品檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司、福建恒安集團(tuán)有限公司、珠海紅塔仁恒包裝股份有限公司、尤妮佳生活用品(中國)有限公司、住友精化(中國)投資有限公司、金佰利(中國)有限公司、國家紙張質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心。I學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載紙、紙板和紙制品抗菌性能的測(cè)定燒瓶試驗(yàn)、抑菌成分轉(zhuǎn)移測(cè)定試驗(yàn)、高吸水材料抑菌性能試驗(yàn)和長(zhǎng)效防霉性能試驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于WS/T650—2019抗菌和抑菌效果評(píng)價(jià)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。采用化學(xué)或物理方法殺滅或妨礙細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，可減少其數(shù)量以及活性的過程。采用化學(xué)或物理方法抑制或妨礙細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖及其活性的過程。4測(cè)定方法和試驗(yàn)菌的選擇根據(jù)樣品性能及使用方式選擇合適的測(cè)定方法。對(duì)于含有溶出性抗菌成分的樣品，或纖維原料(含有非溶出性抗菌成分)具有抗菌功能且吸水性較好的樣品，可選擇載體抗菌試驗(yàn)(第5章)進(jìn)行定量測(cè)定；對(duì)于含有溶出性抑菌成分的樣品，如果進(jìn)行定性測(cè)定，可選擇抑菌環(huán)試驗(yàn)(第6章);對(duì)于含有非溶出性抗菌成分的樣品，經(jīng)鑒定試驗(yàn)確認(rèn)后，可選擇振蕩燒瓶試驗(yàn)(第7章)進(jìn)行定量測(cè)定。樣品吸水性判斷方法：將樣品裁成尺寸為2.0cm×3.0cm的試樣(試樣可疊放，但片數(shù)不得超過3片),在試樣表面滴加100μL菌懸液，如果菌懸液能被試樣完全吸收，則視為該樣品為吸水性較好的根據(jù)其樣品特性選擇相應(yīng)的測(cè)定方法：在鑒別食品接觸用紙、紙板和紙制品中的抑菌成分是否發(fā)生1學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載GB/T42702—2023轉(zhuǎn)移時(shí)，可選擇抑菌成分轉(zhuǎn)移測(cè)定試驗(yàn)(第8章);對(duì)于高吸收性樹脂及含高吸收性樹脂的吸收芯體，可選擇高吸水材料抑菌性能試驗(yàn)(第9章);對(duì)于具有長(zhǎng)效防霉作用的紙、紙板和紙制品，可選擇長(zhǎng)效防霉性能試驗(yàn)(第10章)。進(jìn)行抗菌(抑菌)性能測(cè)定時(shí)，若無特殊說明，應(yīng)使用方法中規(guī)定的細(xì)菌進(jìn)行試驗(yàn)，若標(biāo)明對(duì)真菌或特定微生物有抗菌(抑菌)作用，則應(yīng)使用方法中規(guī)定的真菌或特定微生物進(jìn)行測(cè)定。5載體抗菌試驗(yàn)5.1適用范圍本方法適用于含有溶出性抗菌成分的紙、紙板和紙制品及其原材料，或纖維原料(含有非溶出性抗菌成分)具有抗菌功能且吸水性較好的樣品，進(jìn)行定量抗菌性能測(cè)定。試驗(yàn)所用試劑應(yīng)為分析純或適合于微生物試驗(yàn)用。宜使用現(xiàn)有商業(yè)化的脫水原料制備培養(yǎng)基，并嚴(yán)格按照相關(guān)產(chǎn)品制造商的使用說明操作。氯化鈉5g牛肉膏3g瓊脂15g～20g蒸餾水1000mL葡萄糖40g瓊脂20g磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀蒸餾水2.83g為7.2～7.4,2℃~8℃保存?zhèn)溆谩?Ⅱ級(jí)生物安全柜。學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載GB/T42702—2023恒溫培養(yǎng)箱：溫控精度±1℃。旋渦式振蕩器。高壓蒸汽滅菌鍋。細(xì)菌：大腸桿菌(8099或CICC10899)或大腸桿菌(ATCC25922),金黃色葡萄球菌(ATCC6538根據(jù)產(chǎn)品特定用途所需用的其他菌株。在無菌條件下打開樣品包裝，避開樣品邊緣，將樣品剪成2.0cm×3.0cm的試樣，每片試樣應(yīng)確保試驗(yàn)過程中的菌懸液被完全吸收(滴加菌液后傾斜平皿，無游離液體流出),如1片試樣無法滿足要求，可適當(dāng)增加試樣的片數(shù)(不應(yīng)超過3片)。若試樣需進(jìn)行滅菌處理，可采用高壓滅菌法(121℃,103kPa,15min),如果高壓滅菌法不適用，可采用環(huán)氧乙烷、紫外線照射或其他合適的方法對(duì)試樣進(jìn)行滅菌。若試樣進(jìn)行過滅菌處理，應(yīng)在報(bào)告中注明滅菌方式?？蛇x用與待測(cè)樣品同等材質(zhì)、同等大小但未經(jīng)抗菌處理的樣品作為對(duì)照樣，此時(shí)，試驗(yàn)中對(duì)照樣的層數(shù)應(yīng)與試樣相同；也可選用經(jīng)驗(yàn)證對(duì)微生物生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響的對(duì)照樣品(如不含抗菌成分，與試樣同步操作，作用相同時(shí)間，接種相同菌量，回收菌數(shù)與空白試驗(yàn)回收菌數(shù)的比值>90%的樣品),將其裁剪成與待測(cè)試樣同等大小作為對(duì)照樣。對(duì)照樣應(yīng)經(jīng)高壓消毒滅菌(121℃,103kPa,15min),如果高壓滅菌法不適用，可采用環(huán)氧乙烷或其他合適方法進(jìn)行滅菌。報(bào)告中應(yīng)注明對(duì)照樣品的種類和滅菌方式。取菌株第2代～第5代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(真菌為沙氏瓊脂培養(yǎng)基)新鮮斜面培養(yǎng)物(18h~24h),用5.0mL的PBS洗下菌苔，使菌懸浮均勻后用PBS稀釋至適宜濃度，試驗(yàn)時(shí)每份對(duì)照組回收菌數(shù)應(yīng)為1.0×10?CFU～5.0×10?CFU。5.4試驗(yàn)步驟取試驗(yàn)樣片和對(duì)照樣片各1份，分別置于無菌平皿內(nèi)，用新鮮制備的菌懸液分別在試驗(yàn)樣片與對(duì)照樣片上均勻滴加100μL,每份對(duì)照組回收菌數(shù)應(yīng)為1.0×10?CFU～5.0×10'CFU。開始計(jì)時(shí)，作用至說明書規(guī)定的時(shí)間(最長(zhǎng)不超過120min),用無菌鑷子將試驗(yàn)樣片和對(duì)照樣片分別放入5mL的PBS中，充分混勻，進(jìn)行10倍系列稀釋，選擇適宜稀釋度，吸取0.5mL接種平皿，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平皿，將冷卻至40℃~45℃的熔化營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或沙氏瓊脂培養(yǎng)基傾注于已加入樣液的平皿中，每平皿15mL～20mL,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使其充分混勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，36℃±1℃培養(yǎng)48h(細(xì)菌)或72h(真菌),進(jìn)行活菌菌落計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次，分別計(jì)算抑菌率。5.5計(jì)算公式按公式(1)計(jì)算抑菌率：3學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載GB/T42702—2023…………(1)式中：K—抑菌率，%;N?！獙?duì)照樣平均回收菌落數(shù)，單位為每份對(duì)照樣菌落形成單位(CFU/份);N,——試樣平均回收菌落數(shù)，單位為每份試樣菌落形成單位(CFU/份)。選擇菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間的平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)，若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于20CFU,則選用最低稀釋倍數(shù)菌落數(shù)計(jì)算結(jié)果。分別計(jì)算3次重復(fù)試驗(yàn)的抑菌率，抑菌率結(jié)果修約至小數(shù)點(diǎn)后第1位。若被測(cè)試樣各稀釋度菌落數(shù)均為0,或計(jì)算結(jié)果修約后為100.0%,則抑菌率記為>99.9%。5.6結(jié)果表述5.6.1各次抑菌率均≥50%,表明該樣品相對(duì)于對(duì)照樣具有抗菌作用。5.6.2各次抑菌率均≥90%,表明該樣品相對(duì)于對(duì)照樣具有較強(qiáng)的抗菌作用。5.7注意事項(xiàng)試驗(yàn)過程中，對(duì)于實(shí)際使用時(shí)間較短的產(chǎn)品(如抑菌生活用紙),作用時(shí)間不應(yīng)超過5min;其他產(chǎn)品應(yīng)不超過120min。6抑菌環(huán)試驗(yàn)6.1適用范圍本方法適用于含溶出性抑菌成分，且厚度不超過4.0mm的片(塊)狀物的紙、紙板和紙制品及其原材料的抑菌性能定性測(cè)定；也可用于鑒別試樣中是否含有溶出性抑菌成分。6.2試驗(yàn)材料6.2.1培養(yǎng)基和試劑同5.2.1。6.2.2試驗(yàn)器具恒溫培養(yǎng)箱：溫控精度±1℃。旋渦式振蕩器。高壓蒸汽滅菌鍋。6.2.3試驗(yàn)菌同5.2.3。6.3試樣、陰性對(duì)照樣和試驗(yàn)菌制備6.3.1試樣的制備在無菌條件下打開樣品包裝，避開樣品邊緣，將其制成直徑為5.0mm、厚度不超過4.0mm的圓片4學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載(塊),每4片(塊)一組。若試樣需進(jìn)行滅菌處理，可采用高壓滅菌法(121℃,103kPa,15min),如果高壓滅菌法不適用，可采用環(huán)氧乙烷、紫外線照射或其他合適方法對(duì)試樣進(jìn)行滅菌。若試樣進(jìn)行過滅菌處可選用與待測(cè)樣品同等材質(zhì)、同等大小但未經(jīng)抑菌處理的樣品作為陰性對(duì)照樣，此時(shí)，試驗(yàn)中對(duì)照樣的層數(shù)應(yīng)與試樣相同；也可選用經(jīng)驗(yàn)證不含溶出性抑菌成分的紙或紙板(如定性濾紙),將其制成與待測(cè)試樣同等大小，作為陰性對(duì)照樣。陰性對(duì)照樣應(yīng)經(jīng)高壓消毒滅菌(121℃,103kPa,15min),如果高壓滅菌法不適用，可采用環(huán)氧乙烷或其他合適方法進(jìn)行滅菌。報(bào)告中應(yīng)注明對(duì)照樣品的種類和滅菌取菌株第2代～第5代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(真菌為沙氏瓊脂培養(yǎng)基)新鮮斜面培養(yǎng)物(18h～24h),用PBS洗下菌苔并做適當(dāng)稀釋，制成濃度為5×10?CFU/mL～5×10?CFU/mL的菌懸液，用無菌棉拭子蘸取該菌懸液在適宜的培養(yǎng)基平板表面均勻涂抹3次。每涂抹1次，平板應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng)60°,最后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周。蓋好平板，置于室溫干燥5min。每次試驗(yàn)貼放1個(gè)染菌平板，每個(gè)平板貼放4片試驗(yàn)樣片，1片陰性對(duì)照樣片，共5片。用無菌鑷子取樣片貼放于平板表面，陰性對(duì)照樣片貼于平板中心位置，試驗(yàn)樣片貼于四周。各樣片中心之間相距25mm以上，與平板的周緣相距15mm以上。貼放好后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，置于36℃±1℃培養(yǎng)16h～18h后測(cè)量結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑(包括貼片)并記錄，測(cè)量抑菌環(huán)時(shí)，應(yīng)選均勻而完全無菌生長(zhǎng)的抑菌環(huán)進(jìn)行，測(cè)量其直徑應(yīng)以抑菌環(huán)外沿為界。6.5抑菌作用判別陰性對(duì)照樣片應(yīng)無抑菌環(huán)產(chǎn)生，否則試驗(yàn)無效。試驗(yàn)樣片抑菌環(huán)直徑>7mm者，判別為具有抑菌3次重復(fù)試驗(yàn)，共12個(gè)樣片，均有抑菌作用結(jié)果者，表明試樣具有溶出性抑菌作用，否則表明試樣無溶出性抑菌作用，即樣品中不含有溶出性抑菌成分。7振蕩燒瓶試驗(yàn)本方法適用于含非溶出性抗菌成分的紙、紙板和紙制品及原材料的抗菌性能測(cè)定，不適用于含有高吸收性樹脂的樣品。在進(jìn)行振蕩燒瓶試驗(yàn)前，需要鑒定試驗(yàn)樣品抗菌成分是否可溶出，只有不含溶出性抗菌成分，才能選用振蕩燒瓶法進(jìn)行抗菌性能測(cè)定。如果含有溶出性抗菌成分，則參照第5章載體抗菌試驗(yàn)測(cè)定抗菌學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載7.2試驗(yàn)材料恒溫培養(yǎng)箱：溫控精度±1℃。在無菌條件下打開樣品包裝，避開樣品邊緣，將樣品剪成約為2mm×2mm的小塊，對(duì)于定量較低的樣品(如生活用紙等),可將其剪成約為10mm×10mm的小塊，稱取0.75g試驗(yàn)樣片分裝包好，每個(gè)樣品至少稱取6份試樣備用。必要時(shí)，可采用高壓滅菌法(121℃,103kPa,15min)對(duì)試樣進(jìn)行滅菌，如果高壓滅菌法不適用，可采用環(huán)氧乙烷或其他合適方法對(duì)試樣進(jìn)行滅菌。若試樣進(jìn)行過滅菌處可選用與待測(cè)樣品同等材質(zhì)、同等大小但未經(jīng)抗菌處理的樣品作為對(duì)照樣，此時(shí)，試驗(yàn)中對(duì)照樣的層數(shù)應(yīng)與試樣相同；也可選用經(jīng)驗(yàn)證對(duì)微生物生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響的對(duì)照樣品(如不含抗菌成分，與試樣同步操作，作用相同時(shí)間，接種相同菌量，回收菌數(shù)與空白試驗(yàn)回收菌數(shù)的比值>90%的樣品),將其裁剪成與待測(cè)試樣同等大小作為對(duì)照樣片。對(duì)照樣應(yīng)經(jīng)高壓消毒滅菌(121℃,103kPa,15min),如果高壓滅菌法不適用，可采用環(huán)氧乙烷、紫外線或其他合適方法進(jìn)行滅菌。報(bào)告中應(yīng)注明對(duì)照樣品的種類和滅取菌株第2代～第5代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(真菌為沙氏瓊脂培養(yǎng)基)新鮮斜面培養(yǎng)物(18h～24h),用5.0mL的PBS洗下菌苔，使菌懸浮均勻后用PBS稀釋成適宜濃度，向70mL的PBS中加入5mL菌懸7.4非溶出性抗菌材料的鑒定取至少1g樣品置于盡量少的無菌蒸餾水中浸泡24h,并確保在浸泡后至少可以吸取20mL游離液體，按照WS/T650—2019中5.1.1懸液定量抑菌試驗(yàn)法驗(yàn)證浸泡液是否具有抑菌作用，試驗(yàn)中試驗(yàn)菌與浸泡液作用時(shí)間為2h;或?qū)悠凡贸芍睆?mm圓片，采用抑菌環(huán)試驗(yàn)鑒別抗菌產(chǎn)品中是否含有6學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載GB/T42702—2023可溶性抑菌成分。若樣品浸泡液無抑菌作用或采用抑菌環(huán)法判定為不含有溶出性抑菌物質(zhì)，說明樣品屬非溶出性抗菌材料。7.5試驗(yàn)步驟7.5.1試驗(yàn)組：取已提前備好的2份試驗(yàn)樣片分別置于250mL錐形瓶中，向錐形瓶中加入70mL的PBS和5.0mL新鮮制備的菌懸液，試驗(yàn)菌在錐形瓶中濃度應(yīng)為1×10?CFU/mL～5×10?CFU/mL。7.5.2將試驗(yàn)組中的一個(gè)錐形瓶振蕩混勻，吸取1mL內(nèi)容物，作為試驗(yàn)組振蕩前樣液。7.5.3將試驗(yàn)組另一個(gè)錐形瓶固定于振蕩搖床()上，以250r/min～300r/min振搖1h,吸取7.5.4用PBS對(duì)振蕩前和振蕩后樣液進(jìn)行10倍系列稀釋，選擇適宜稀釋度，各吸取1mL內(nèi)容物接種平皿，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平皿，將冷卻至40℃~45℃的熔化營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或沙氏瓊脂培養(yǎng)基傾注于已加入樣液的平皿中，每平皿15mL～20mL,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使其充分混勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，36℃±1℃培養(yǎng)48h(細(xì)菌)或72h(真菌),進(jìn)行活菌菌落計(jì)數(shù)。7.5.5試驗(yàn)同時(shí)設(shè)對(duì)照樣片組和不加樣片組。對(duì)照樣片組使用對(duì)照樣片代替待測(cè)試驗(yàn)樣片，其他操作程序與試驗(yàn)組相同。不加樣片組除不加試驗(yàn)樣片外，其他操作程序與試驗(yàn)組相同。7.5.6試驗(yàn)重復(fù)3次，分別計(jì)算每次試驗(yàn)中試驗(yàn)樣片和對(duì)照樣片的抑菌率。7.6計(jì)算公式按公式(2)分別計(jì)算試驗(yàn)樣片和對(duì)照樣片抑菌率：K—抑菌率，%;…………(選擇菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間的平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)，若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于20CFU,則選用最低稀釋倍數(shù)菌落數(shù)計(jì)算結(jié)果。每次重復(fù)試驗(yàn)分別計(jì)算抑菌率，試驗(yàn)組抑菌率使用試驗(yàn)樣片振蕩前后菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)算，對(duì)照組抑菌率使用對(duì)照樣片振蕩前后菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)算，當(dāng)試驗(yàn)樣片振蕩前回收菌落數(shù)明顯少于對(duì)照樣片振蕩前菌落數(shù)時(shí)，應(yīng)使用對(duì)照樣片振蕩前菌落數(shù)代替試驗(yàn)樣片振蕩前菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)算。抑菌率結(jié)果修約至小數(shù)點(diǎn)后第1位，并計(jì)算每次試驗(yàn)中試驗(yàn)樣片和對(duì)照樣片的抑菌率差值。試驗(yàn)中，在實(shí)驗(yàn)誤差允許的范圍內(nèi)，如果試驗(yàn)樣片和對(duì)照樣片出現(xiàn)振蕩后菌落數(shù)高于振蕩前菌落數(shù)7.7結(jié)果表述7.7.1不加樣片組活菌計(jì)數(shù)在1.0×10?CFU/mL～5.0×10?CFU/mL之間，且振蕩前后平均菌落數(shù)差值在算術(shù)平均值的10%以內(nèi)，試驗(yàn)有效。7.7.2各次試驗(yàn)中，試驗(yàn)樣片抑菌率與對(duì)照樣片抑菌率的差值均>26%,表明樣品相對(duì)于對(duì)照樣具有抗菌作用。7.8注意事項(xiàng)振蕩前應(yīng)將振蕩搖床上的錐形瓶固定牢，以免碰破。GB/T42702—20238抑菌成分轉(zhuǎn)移測(cè)定試驗(yàn)8.1適用范圍本方法適用于測(cè)定食品接觸用紙和紙板中的抑菌成分是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。8.2試驗(yàn)材料試驗(yàn)所用試劑應(yīng)為分析純或適合于微生物試驗(yàn)用。宜使用現(xiàn)有商業(yè)化的脫水原料制備培養(yǎng)基，并嚴(yán)格按照相關(guān)產(chǎn)品制造商的使用說明操作。氯化鈉5g牛肉膏3g蒸餾水1000mL蛋白胨5g胰酪蛋白5g葡萄糖40g酪蛋白胨、酶水解胰蛋白胨蛋白胨氯化鈉瓊脂蒸餾水蛋白胨葡萄糖麥芽糖瓊脂蒸餾水8學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載GB/T42702—2023蛋白胨鹽溶液酶水解酪蛋白胨氯化鈉蒸餾水濃度0.03U/mL。Ⅱ級(jí)生物安全柜。恒溫培養(yǎng)箱：溫控精度±1℃。旋渦式振蕩器。高壓蒸汽滅菌鍋。恒溫水浴鍋。離心機(jī)：轉(zhuǎn)速能達(dá)到4000r/min。沖樣器：可將試樣制成直徑為10mm～15mm的圓形測(cè)試片，可進(jìn)行消毒。試管、燒杯、錐形瓶、接種環(huán)、移液器等實(shí)驗(yàn)室常用器具。細(xì)菌：枯草芽孢桿菌(ATCC6633)。根據(jù)產(chǎn)品特定用途所需用的其他菌株。8.3試樣、對(duì)照樣和菌懸液制備在無菌條件下打開樣品包裝，食品接觸面作為試驗(yàn)組，若兩面均與食品接觸或兩面無法確定是否與食品接觸時(shí)，則兩面都應(yīng)進(jìn)行測(cè)試，每一面均應(yīng)視為獨(dú)立樣品測(cè)試。避開樣品邊緣，將試樣制成直徑為10mm～15mm的圓片。8.3.2陽性對(duì)照樣枯草芽孢桿菌陽性對(duì)照樣：取無菌定性濾紙，制成與試樣同等大小的圓片。用青霉素G溶液()浸沒無菌定性濾紙，自然晾干。黑曲霉陽性對(duì)照樣：取無菌定性濾紙，制成與試樣同等大小的圓片。用兩性霉素B溶液()浸沒無菌定性濾紙，自然晾干。8.3.3枯草芽孢桿菌孢子懸浮液的制備枯草芽孢桿菌接種至營養(yǎng)瓊脂斜面上并在30℃±2℃下培養(yǎng)7d,獲得枯草芽孢桿菌的工作9學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載GB/T42702—2023培養(yǎng)物。培養(yǎng)后，將試管保存在2℃~8℃。取10支枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)物，每支用2.0mL～3.0mL的無菌蛋白胨鹽溶液沖洗，制得菌懸液，將每支斜面制得的菌懸液分別接種在10塊營養(yǎng)瓊脂平皿上，30℃±2℃下培養(yǎng)7d。每個(gè)平皿用3.0mL的無菌蛋白胨鹽溶液沖洗菌落，收集10個(gè)平皿的孢子懸液。將孢子懸液轉(zhuǎn)移至無菌瓶中，85℃振蕩水浴30min,加熱后，將孢子懸浮液全部轉(zhuǎn)移至40.0mL無菌離心瓶中。4000r/min離心10min,棄去上層清液。用30.0mL無菌蛋白胨鹽溶液沖洗殘留物，然后再次離心。重復(fù)洗滌3次。將得到的枯草芽孢桿菌孢子保存在20.0mL的無菌蛋白胨鹽溶液中，制得枯草芽孢桿菌孢子懸浮液。該懸浮液可以在2℃~8℃下保存，保存時(shí)間不超過4周。8.3.4黑曲霉孢子懸浮液的制備黑曲霉接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面上并在25℃±2℃下培養(yǎng)5d,獲得黑曲霉的工作培養(yǎng)物。培養(yǎng)后，將試管在2℃~8℃下保存。取5支黑曲霉工作培養(yǎng)物，用接種環(huán)將每支黑曲霉工作培養(yǎng)物分別接種在5塊沙氏葡萄糖瓊?cè)o菌蛋白胨鹽溶液濕潤(rùn)接種環(huán)，將孢子轉(zhuǎn)移至10mL無菌蛋白胨鹽溶液中。該懸浮液可以在2℃~8℃下保存，保存時(shí)間不超過4周。8.4試驗(yàn)步驟每個(gè)樣品至少準(zhǔn)備3個(gè)培養(yǎng)皿進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)時(shí)與食品接觸的一面朝下與培養(yǎng)基接觸，若無法確定食品接觸面，樣品兩面都應(yīng)進(jìn)行測(cè)試，每一面均應(yīng)視為獨(dú)立樣品。8.4.2枯草芽孢桿菌測(cè)試試驗(yàn)組：將改良營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基()冷卻至60℃以下，加入保存的枯草芽孢桿菌孢子(見),使孢子濃度為1.0×10?個(gè)/mL～5.0×104個(gè)/mL,小心搖動(dòng)使孢子懸浮液均勻分布，取約15mL倒入培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)基凝固前，用無菌鉗或鑷子在每個(gè)平皿上放置3個(gè)測(cè)試片。用合適的無菌器具輕輕向下壓測(cè)試片，確保樣品與瓊脂之間沒有空隙。試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)平皿包含3個(gè)測(cè)試片，共9個(gè)測(cè)試片。每次試驗(yàn)同時(shí)設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照組和一個(gè)陽性對(duì)照組。陰性對(duì)照組不放試樣，其他操作程序與試驗(yàn)組相同；使用枯草芽孢桿菌陽性對(duì)照樣()代替待測(cè)試樣，其他操作與試驗(yàn)組相同。8.4.3黑曲霉測(cè)試試驗(yàn)組：將改良沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基()冷卻至60℃以下，加入保存的黑曲霉孢子懸浮液(見),使孢子濃度為1.0×105個(gè)/mL～5.0×105個(gè)/mL,小心搖動(dòng)使孢子懸浮液均勻分布，取約15mL倒入培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)基凝固前，用無菌鉗或鑷子在每個(gè)平皿上放置3個(gè)測(cè)試片。用合適的無菌器具輕輕向下壓測(cè)試片，確保樣品與瓊脂之間沒有空隙。試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)平皿包含3個(gè)測(cè)試片，共9個(gè)測(cè)試片。每次試驗(yàn)同時(shí)設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照組和一個(gè)陽性對(duì)照組。陰性對(duì)照組不放試樣，其他操作程序與試驗(yàn)組相同；使用黑曲霉陽性對(duì)照樣()代替待測(cè)試樣，其他操作程序與試驗(yàn)組相同。將8.4.2或8.4.3制備的培養(yǎng)皿在5℃土3℃條件下保存2h。翻轉(zhuǎn)平皿，將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中，學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載30℃±2℃培養(yǎng)3d(枯草芽孢桿菌)或25℃±2℃培養(yǎng)5d(黑曲霉)。培養(yǎng)過程中，應(yīng)每天觀察平皿中是否有抑菌區(qū)出現(xiàn)。8.5.1使用游標(biāo)卡尺測(cè)量測(cè)試片周圍半透明區(qū)域?qū)挾龋?dāng)半透明區(qū)域?qū)挾取?mm時(shí)，判定該測(cè)試片存8.5.2若測(cè)試片周圍菌落形態(tài)發(fā)生改變，間距變寬，直徑變大，但測(cè)試片周圍沒有≥2mm的半透明區(qū)8.5.3若測(cè)試片被微生物污染，僅在污染微生物周圍存在≥2mm的半透明區(qū)域，但測(cè)試片周圍沒有≥2mm的半透明區(qū)域，判定該測(cè)試片不存在抑菌區(qū)。8.6.2每個(gè)陽性對(duì)照樣周圍均應(yīng)觀察到寬度≥2mm的抑菌區(qū)，否則，應(yīng)8.6.39個(gè)測(cè)試片中至少有2個(gè)存在抑菌區(qū)，則判定樣品有抑菌成分轉(zhuǎn)移。8.7.2在試驗(yàn)過程中，應(yīng)每天觀察試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)現(xiàn)象應(yīng)逐天觀察，若有抑菌區(qū)出現(xiàn)則可判定樣品有抑9高吸水材料抑菌性能試驗(yàn)本方法適用于高吸收性樹脂及含有高吸收性樹脂的吸收芯體抑菌性能的測(cè)定。在進(jìn)行本試驗(yàn)前，需要鑒定其抑菌成分是否可溶出，并在報(bào)告中注明非溶出性抑菌材料的鑒定結(jié)果。對(duì)于含有高吸收性樹脂的紙制品(如衛(wèi)生巾、紙尿褲等),如果聲稱高吸收性樹脂或含高吸收性樹脂的吸收層具有抑菌作用，可按此方法進(jìn)行產(chǎn)品中含高吸收性樹脂吸收芯體層的抑菌性能測(cè)定。蛋白胨氯化鈉牛肉粉葡萄糖蒸餾水吐溫80。學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載其他培養(yǎng)基和試劑同5.2.1。9.2.2試驗(yàn)器具Ⅱ級(jí)生物安全柜。恒溫培養(yǎng)箱：溫控精度±1℃。旋渦式振蕩器。高壓蒸汽滅菌鍋。尼龍布：孔徑為61μm(250目)。尼龍布袋：孔徑為61μm(250目),10cm×15cm。9.2.3試驗(yàn)菌同5.2.3。9.3試樣、對(duì)照樣和菌懸液的制備9.3.1試樣的制備若樣品為高吸收性樹脂或復(fù)合吸收芯體，可直接用于試驗(yàn)；若樣品為含高吸收性樹脂的衛(wèi)生巾、紙尿褲等紙制品，則選取具有抑菌作用且含高吸收性樹脂的吸收芯體部分，將其剪成5mm×5mm的大小，所取試樣不應(yīng)包含面層和底膜材料。9.3.2對(duì)照樣的制備可選用與待測(cè)樣品同等材質(zhì)、同等大小但不含抑菌成分或未經(jīng)抑菌處理的樣品作為對(duì)照樣，此時(shí)對(duì)照樣應(yīng)與試樣選自相同部位。也可選用經(jīng)驗(yàn)證對(duì)微生物生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響的對(duì)照樣品(如不含抑菌成分，與試樣同步操作，作用相同時(shí)間，接種相同菌量，回收菌數(shù)與空白試驗(yàn)回收菌數(shù)的比值>90%的樣品),將其剪成5mm×5mm大小，經(jīng)高壓消毒滅菌(121℃,103kPa,15min)后，備用。報(bào)告中應(yīng)注明對(duì)照樣品的種類。9.3.3菌懸液的制備取菌株第2代～第5代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(真菌為沙氏瓊脂培養(yǎng)基)新鮮斜面培養(yǎng)物(18h~24h),用5.0mL營養(yǎng)肉湯洗下菌苔，使菌懸浮均勻后繼續(xù)用營養(yǎng)肉湯稀釋至1.0×103CFU/mL~9.4吸液量的測(cè)定取測(cè)試樣品和對(duì)照樣品，各稱1.00g±0.01g,各自放入10cm×15cm的尼龍布袋中。分別將含有測(cè)試樣品、對(duì)照樣品的尼龍布袋以及不含樣品的空尼龍布袋稱重后放入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，浸泡30min(將樣品壓到液面下，注意去除氣泡)后，吊起尼龍布袋20min后再分別稱重。測(cè)試樣品、對(duì)照樣品以及空的尼龍布袋分別測(cè)定三次吸液量取平均值。試樣和對(duì)照樣吸液量的組內(nèi)誤差率不應(yīng)超吸液量按公式(3)和公式(4)計(jì)算： 吸液量組內(nèi)誤差按公式(5)計(jì)算： 式中：S;—各個(gè)樣品所吸收的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基質(zhì)量，單位為克(g);Mj—吸收后的含有吸液樣品的尼龍布袋的質(zhì)量，單位為克(g);B--吸收后尼龍布袋的質(zhì)量，單位為克(g);mj——吸收前樣品的質(zhì)量，單位為克(g);V—樣品平均吸液量，單位為克(g);E—吸液量組內(nèi)誤差率。9.5非溶出性抑菌材料的鑒定取約1g樣品于無菌錐形瓶中，根據(jù)9.4計(jì)算的樣品平均吸液量進(jìn)行換算，向其中加入(V+20)mL的無菌生理鹽水，浸泡24h,剪取適宜大小的無菌尼龍布于錐形瓶中，用移液槍輕抵在尼龍布上吸取浸泡液，應(yīng)確保吸取的浸泡液體積滿足后續(xù)檢驗(yàn)需求，若可吸取的浸泡液體積不足，應(yīng)適當(dāng)增加用于浸泡樣品的生理鹽水體積。按照WS/T650—2019中5.1.1懸液定量抑菌試驗(yàn)法驗(yàn)證浸泡液是否具有抑菌作用，試驗(yàn)中試驗(yàn)菌與浸泡液作用時(shí)間為2h。若浸泡液無抑菌作用，則判定該樣品為非溶出性抑菌材料。9.6試驗(yàn)步驟9.6.1一般要求試驗(yàn)組和對(duì)照組應(yīng)使用相同的菌懸液進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3次，分別計(jì)算抑菌率。9.6.2試驗(yàn)組取0.200g±0.002g試樣分別放入2支無菌試管中，根據(jù)9.4計(jì)算的試樣平均吸液量進(jìn)行換算，向試樣中輕輕滴入試樣吸液量同體積的菌懸液，菌懸液不應(yīng)接觸到試管壁。靜置15min讓試樣充分吸收菌懸液后，輕輕地蓋上試管蓋，不應(yīng)振蕩或攪拌。取1支試管作為“0”培養(yǎng)時(shí)間試樣。另外1支試管在36℃±1℃培養(yǎng)24h,作為培養(yǎng)后試樣。向試驗(yàn)組“0”培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)后的試樣中加入相應(yīng)吸液量2倍的含2%吐溫80的0.85%氯化鈉溶液，蓋緊蓋子，用旋渦式振蕩器()充分振蕩，振蕩5次，每次5s。剪取適宜大小的無菌尼龍布于試管中，用移液槍輕抵尼龍布，分別吸取振蕩后的“0”培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)后的試樣樣液，使用0.85%的氯化鈉溶液進(jìn)行10倍系列稀釋，選擇適宜稀釋度，取1.0mL接種平皿，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平皿，將冷卻至40℃~45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌)或沙氏瓊脂培養(yǎng)基(真菌)注于已加入樣液的平皿中，每平皿15mL～20mL,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使其充分混勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，36℃±1℃培養(yǎng)48h(細(xì)菌)或72h(真菌),進(jìn)行活菌菌落計(jì)數(shù)。9.6.3對(duì)照組取0.200g±0.002g對(duì)照樣分別放入2支無菌試管中，根據(jù)9.4計(jì)算的對(duì)照樣吸液量進(jìn)行換算，分別向?qū)φ諛又休p輕滴入對(duì)照樣吸液量同體積的菌懸液，菌懸液不應(yīng)接觸到試管壁。靜置15min讓對(duì)照樣充分吸收菌懸液后，輕輕地蓋上試管蓋，請(qǐng)勿振蕩或攪拌。取1支試管作為“0”培養(yǎng)時(shí)間對(duì)照樣。另外1支試管在36℃±1℃培養(yǎng)24h,作為培養(yǎng)后對(duì)照樣。向?qū)φ战M中的“0”培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)后對(duì)照樣中分別加入相應(yīng)吸液量2倍的含2%吐溫80的0.85%的氯化鈉溶液，蓋緊蓋子，用旋渦式振蕩器充分振蕩，振蕩5次，每次5s。剪取適宜大小的無菌尼龍布于試管中，用移液槍輕抵尼龍布，分別吸取振蕩后的“0”培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)后的對(duì)照樣品樣液，用0.85%的氯化鈉溶液進(jìn)行10倍系列稀釋，選擇適宜稀釋度，取1.0mL接種平皿，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平皿，將冷卻至40℃~45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或沙氏瓊脂培養(yǎng)基注于已加入樣液的平皿中，每平皿15mL～20mL,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使其充分混勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，36℃±1℃培養(yǎng)48h(細(xì)菌)或72h(真菌),進(jìn)行活菌菌落計(jì)數(shù)。9.7計(jì)算公式按公式(6)計(jì)算抑菌率：…………式中：K—抑菌率，%;N?！佑|24h后對(duì)照樣平均菌落數(shù)，單位為每毫升菌落形成單位(CFU/mL);N、—接觸24h后試樣平均菌落數(shù)，單位為每毫升菌落形成單位(CFU/mL)。選擇菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間的平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)，若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于20CFU,則選用最低稀釋倍數(shù)菌落數(shù)計(jì)算結(jié)果。3次重復(fù)試驗(yàn)分別計(jì)算抑菌率，抑菌率結(jié)果修約至小數(shù)點(diǎn)后第1位。若被測(cè)試樣各稀釋度菌落數(shù)均為0,或計(jì)算結(jié)果修約后為100.0%,則抑菌率記為>99.9%。9.8試驗(yàn)成立條件對(duì)照組"0"時(shí)回收菌量不少于1.0×103CFU/mL～1.0×10?CFU/mL,且培養(yǎng)24h后的回收菌量對(duì)數(shù)值(lg)比“0”時(shí)增加2以上。9.9注意事項(xiàng)9.9.1吸取回收液接種培養(yǎng)時(shí)，如混入高吸收性樹脂可能會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。9.9.2某些菌種在不同對(duì)照樣中的回收菌數(shù)可能差異較大，因此對(duì)照樣品的選擇對(duì)抑菌率測(cè)定結(jié)果可能會(huì)產(chǎn)生較大影響。9.9.3采用本方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，抑菌率>99%可以認(rèn)為樣品相對(duì)于對(duì)照樣具有較好的抑菌作用。9.9.4若樣品中含溶出性抑菌成分，采用本方法測(cè)得的抑菌率結(jié)果相對(duì)較高。10長(zhǎng)效防霉性能試驗(yàn)10.1適用范圍本方法適用于測(cè)定紙、紙板和紙制品的長(zhǎng)效防霉性能，如壁紙等。10.2設(shè)備和材料10.2.1恒溫恒濕培養(yǎng)箱：溫度能保持在28℃±2℃,相對(duì)濕度能保持在90%±5%。10.2.2Ⅱ級(jí)生物安全柜。10.2.4冰箱：溫度能保持在2℃~8℃。10.2.5高壓蒸汽滅菌鍋。學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載GB/T42702—2023試驗(yàn)所用試劑應(yīng)為分析純或適合于微生物試驗(yàn)用。宜使用現(xiàn)有商業(yè)化的脫水原料制備培養(yǎng)基，并嚴(yán)格按照相關(guān)產(chǎn)品制造商的使用說明操作。磷酸二氫鉀2.5g硫酸鎂0.2g硝酸銨3.0g硫酸亞鐵0.1g磷酸氫二鉀2.0g瓊脂20g無機(jī)鹽營養(yǎng)液(見10.3.1)1000mL馬鈴薯200g蔗糖20.0g瓊脂20.0g聚山梨醇酯80(吐溫80)。用100mL蒸餾水加0.05g分散劑(10.3.5),充分混勻后，按每只10mL分裝到無色玻璃試管中，放入高壓滅菌鍋，于121℃、1kPamin球毛殼霉(CGMCC3.3601繩狀青霉(CGMCC3.3875綠色木霉(CGMCC3.2941或ATCC或ATCC或ATCC6205);學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載GB/T42702—2023防霉試驗(yàn)使用的菌株應(yīng)由省級(jí)或國家級(jí)的菌種保藏機(jī)構(gòu)提供。如果需要，可增加