苯酚-硫酸比色法測(cè)定白多糖的研究

苯酚-硫酸比色法測(cè)定白多糖的研究

白蠟樹是蘭科植物的干燥莖，也被稱為小白牙、蓮草和雪末。白芨多糖具有收斂止血、消腫生肌等功能實(shí)驗(yàn)以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,采用苯酚-硫酸比色法(硫酸將白芨多糖催化水解成單糖,單糖迅速脫水生成糠醛及其衍生物再與苯酚或蒽酮作用生成有色物質(zhì)1材料和方法1.1材料表面1.1.1蘭科白(白)白芨:購買于瑞麗市臺(tái)麗街綜合批發(fā)市場(chǎng)(經(jīng)鑒定為蘭科白芨屬白芨)。將白芨塊莖洗凈,瀝干,切片,放入烘箱60℃烘干、粉碎后,過40目篩,收集,放入干燥器中密封保存,備用。1.1.2試劑葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,優(yōu)級(jí)純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;苯酚,分析純,天津市化學(xué)試劑三廠;濃硫酸,分析純,重慶東川化工。1.1.3紫外-可見分光光度儀、電子天平、藥材粉碎機(jī)T6型紫外-可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限公司);UV-8000ST紫外-可見分光光度儀(上海元析儀器有限公司);電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);中藥材粉碎機(jī)(臺(tái)灣弘荃機(jī)械企業(yè)有限公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。1.2方法1.2.1濾渣的提取稱取白芨粗粉2.0kg,用75%乙醇提取2次,每次2h,過濾,濾渣干燥。稱取干燥后的濾渣1.0kg,加入15倍量的水提取2h,離心過濾后,濾渣再用10倍量的水提取2h,合并濾液。將濾液濃縮至相對(duì)密度為1.15,加入95%乙醇,邊加邊攪拌,直至大量沉淀產(chǎn)生,靜置過夜,濾出沉淀,干燥、粉碎即得白芨粗多糖。1.2.2白粗多糖待測(cè)樣品溶液的制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制精密稱取已恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1001g,溶解后,轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,定容至刻度,充分搖勻,靜置30min。吸取2.0mL于50mL容量瓶中,定容,搖勻后,即得40.04ug/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。待測(cè)樣品溶液配制精密稱取已恒重的白芨粗多糖0.1000g,溶解后,轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,定容至刻度,充分搖勻靜置30min。吸取2.0mL于50mL容量瓶中,定容,搖勻后,即得白芨粗多糖待測(cè)樣品溶液。6%苯酚溶液的配制精密稱取苯酚6.00g,溶解后,轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中,定容,充分搖勻,靜置,避光保存。1.2.3濃硫酸溶液的加入分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0mL于2支具塞比色管中,使總體積均為1.0mL,加入6%苯酚溶液1.2mL,搖勻后,沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5mL,搖勻,靜置,冷卻。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0mL為空白對(duì)照,選擇400～600nm波長(zhǎng)范圍,按10.0nm的精度進(jìn)行多波長(zhǎng)掃描,以吸收波長(zhǎng)λ為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制吸光度-吸收波長(zhǎng)關(guān)系曲線,確定最大吸收波長(zhǎng)。1.2.4濃硫酸加入量分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0mL,置于9支具塞比色管中,依次加入6%苯酚溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL,加水使各管體積均為3.2mL,搖勻,各管分別沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5mL,搖勻,靜置30min。冷水冷卻,于490nm處測(cè)定吸光度。以苯酚用量為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制吸光度-苯酚用量關(guān)系曲線,確定苯酚溶液用量。1.2.5濃硫酸加入量分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0mL,置于9支具塞比色管中,依次加入6%苯酚溶液1.2mL,搖勻后沿管壁緩慢加入濃硫酸3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0mL,加水使各管體積均為9.2mL,搖勻靜置60min。冷水冷卻后,于490nm處測(cè)定吸光度。以濃硫酸用量為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制吸光度-濃硫酸用量曲線,確定濃硫酸用量。1.2.6濃硫酸溫度的確定分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00mL,置于9支具塞比色管中,加入6%苯酚溶液1.2mL,搖勻后沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5mL,搖勻,分別靜置10、20、30、40、50、60、70、80、90min。冷水冷卻后,于490nm處測(cè)定吸光度。以反應(yīng)時(shí)間t為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制吸光度-反應(yīng)時(shí)間曲線,確定反應(yīng)的適宜時(shí)間及穩(wěn)定性。1.2.7葡萄糖吸光度的測(cè)定分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于具塞比色管中,加水使體積均為1.0mL,加入6%苯酚溶液1.2mL,搖勻后沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5mL,搖勻靜置60min。冷水冷卻后,以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0mL為空白對(duì)照,于490nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.8濃硫酸溶液的加入分別精確吸取1.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于5支具塞比色管中,加入6%苯酚溶液1.2mL,搖勻后沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5mL,搖勻靜置60min。冷水冷卻后,以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0mL份為空白對(duì)照,于490nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)。1.2.9苯酚用量的確定精密稱取白芨樣品5份,每份質(zhì)量0.1000g,依次向白芨樣品中加入0.0700g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,溶解定容至100mL容量瓶中,搖勻,靜置。吸取2.0mL白芨樣品溶液,定容于50mL容量瓶,搖勻,靜置。吸取0.4mL于具塞比色管中,加水使體積均為1.0mL,分別加入6%苯酚溶液1.2mL,搖勻后沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5mL,搖勻,靜置60min,冷水冷卻后,以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0mL為空白對(duì)照,于490nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算多糖含量及加標(biāo)回收率。加標(biāo)回收率=(加標(biāo)后多糖測(cè)定量-樣品中多糖量)/葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品加入量×100%1.2.1濃硫酸溶液的配制精密稱取已恒重的白芨粗多糖6份,每份質(zhì)量0.1000g,配制成白芨粗多糖待測(cè)樣品溶液,吸取6份待測(cè)樣品溶液各1.0mL于具塞比色管中,加入6%苯酚溶液1.2mL,搖勻后沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5mL,搖勻,靜置60min。冷水冷卻后,于490nm處測(cè)定吸光度,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算白芨粗多糖樣品中多糖含量。2結(jié)果與分析2.1吸收最大波長(zhǎng)的選擇由表1、圖1可知,最大吸收波長(zhǎng)為490nm。2.2苯酚用量的影響由表2、圖2可知。苯酚用量在0.2～1.2mL,吸光度與苯酚用量呈正相關(guān),且具有一定線性關(guān)系;當(dāng)苯酚用量達(dá)到1.2mL時(shí),吸光度出現(xiàn)最大值;之后,隨著苯酚用量的增加,吸光度反而逐漸下降。因此,最佳苯酚用量為1.2mL。2.3濃硫酸用量的影響由表3、圖3可知,使用1.2mL6%的苯酚溶液,濃硫酸用量在3.0～6.5mL時(shí),吸光度與濃硫酸用量呈正相關(guān);當(dāng)濃硫酸用量達(dá)到6.5mL時(shí),吸光度出現(xiàn)最大值;之后,隨著濃硫酸用量的增加,吸光度呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。因此,最佳硫酸用量為6.5mL。2.4反應(yīng)時(shí)間和時(shí)間對(duì)吸光度的影響由表4、圖4可知,在1.2mL6%苯酚溶液,6.5mL濃硫酸條件下,反應(yīng)時(shí)間為10～60min時(shí),吸光度值呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì);當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為60min時(shí),吸光度出現(xiàn)最大值;之后,隨反應(yīng)時(shí)間增加,吸光度呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。由此,可以確定加入濃硫酸后的最佳反應(yīng)時(shí)間為60min,總體來說,反應(yīng)時(shí)間內(nèi),吸光度變化較小,呈現(xiàn)比較穩(wěn)定的變化趨勢(shì)。2.5吸光度值-葡萄糖濃度的線性回歸通過對(duì)吸光度-葡萄糖濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸,得到吸光度值-葡萄糖濃度的線性回歸方程:y=0.009x+0.0023,線性相關(guān)系數(shù)R2.6u3000標(biāo)準(zhǔn)偏差由表6可知,精密度實(shí)驗(yàn)的平均吸光度為0.2984,標(biāo)準(zhǔn)偏差STDEV為0.00343,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.148%。表明該方法精密度較高,滿足實(shí)驗(yàn)要求。2.7加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)由表7可知,5份平行樣測(cè)定的加標(biāo)回收率為98.24%～100.29%,平均加樣回收率為99.11%,標(biāo)準(zhǔn)偏差STDEV值為0.7565,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.7633%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿足加標(biāo)回收率要求,表明該方法的準(zhǔn)確度較好。2.8實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表8可知,白芨多糖平行樣品測(cè)定的多糖含量為65.5%～66.5%,平均多糖含量為66.08%,標(biāo)準(zhǔn)偏差STDEV值為0.3764,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.5696%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿足相關(guān)要求,方法重現(xiàn)性好。3白多糖水解液的制備由于苯酚是一種弱酸性的酚類物質(zhì),在空氣中久置很容易吸水潮解或部分氧化為苯醌,導(dǎo)致純度、有效濃度下降,進(jìn)而影響顯色反應(yīng),使測(cè)定結(jié)果有所偏離。因此,苯酚需要密封存放在干燥環(huán)境中,且現(xiàn)配現(xiàn)用;濃硫酸在反應(yīng)中主要是將白芨多糖水解為單糖,并脫水生成糖醛衍生物。實(shí)驗(yàn)過程中,濃硫酸與樣品反應(yīng)若搖動(dòng)不充分,使多糖水解為單糖不徹底也會(huì)影響多糖含量的測(cè)定結(jié)果。因此,為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,加入濃硫酸后應(yīng)充分搖勻,靜置水解,以減小實(shí)驗(yàn)測(cè)