高效液相色譜檢測技術(shù)課件

高效液相色譜檢測技術(shù)

教師：劉深勇高效液相色譜檢測技術(shù)

教師：劉深勇內(nèi)容概要工作原理結(jié)構(gòu)組成常見故障與維護(hù)HPLC概述HPLC應(yīng)用內(nèi)容概要工作原理結(jié)構(gòu)組成常見故障與維護(hù)HPLC概述HPLC應(yīng)高效液相色譜法(HPLC)是上個(gè)世紀(jì)七十年代迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高效、快速的分析分離技術(shù)，是現(xiàn)代分離測試的重要手段。色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相(stationphase)發(fā)生作用(吸附、分配、排阻、親和)的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。一、HPLC簡介高效液相色譜法(HPLC)是上個(gè)世紀(jì)七十年代

HPLC即Highperformanceliquidchromatography,或Highpressureliquidchromatography，譯為：高效液相或高壓液相。高效液相色譜法(HPLC)是上個(gè)世紀(jì)七十年代迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高效、快速的分析分離技術(shù)，是現(xiàn)代分離測試的重要手段。色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相(stationphase)發(fā)生作用(吸附、分配、排阻、親和)的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。一、HPLC簡介HPLC即HighperformanceHPLC是在經(jīng)典的液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其以液體作為流動相，并采用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。其分離機(jī)制與常規(guī)柱色譜相同，但填料更加精細(xì)，需高壓泵推動，柱效高，分析速度快。與氣相色譜不同的是液相色譜中流動相亦參與組分的分離過程，其組成、比例和pH值可靈活調(diào)節(jié)，分離模式多樣。在實(shí)際操作中主要通過改變流動相的組成來調(diào)節(jié)樣品在色譜柱的保留值和選擇性，從而使不同樣品得到分離。HPLC是在經(jīng)典的液相色譜法基礎(chǔ)

高效液相色譜法自20世紀(jì)60年代問世以來，由于使用了高壓輸液泵、全多孔微粒填充柱和高靈敏度檢測器，實(shí)現(xiàn)了對樣品的高速、高效和高靈敏度的分離測定。高效液相色譜由于吸取了經(jīng)典液相色譜的研制經(jīng)驗(yàn)，并引入微處理機(jī)技術(shù)，極大的提高了儀器的自動化水平和分析精度。現(xiàn)在用微處理機(jī)控制的高效液相色譜儀，其自動化程度很高，既能控制儀器的操作參數(shù)(如溶劑梯度洗脫、流動相流量、柱溫、自動進(jìn)樣、洗脫液收集、檢測器功能等)，又能對獲得的色譜圖進(jìn)行收縮、放大、疊加，以及對保留數(shù)據(jù)和峰高、峰面積進(jìn)行處理等，為色譜分析工作者提供了高效率、功能齊全的分析工具。

高效液相色譜法自20世紀(jì)60年代問世以

高效液相色譜法的應(yīng)用范圍十分廣泛，對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點(diǎn)、極性、離子型化合物和大分子物質(zhì)均可用高效液相色譜法分析測定，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來分析。HPLC因其具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度好、能分析和分離高沸點(diǎn)且不能氣化的熱不穩(wěn)定生理活性物質(zhì)的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、藥物及臨床分析，世界各國己將該法收載于藥典。高效液相色譜法的應(yīng)用范圍十分廣泛，高壓：液體作為流動相流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，施加高壓能使液體迅速通過，一般高達(dá)150-350×105Pa。高速：載液在色譜柱內(nèi)的流速較之經(jīng)典液相色譜法高得多，一般可達(dá)1-10mL/min。高效：高效液相色譜法的柱效能可達(dá)3萬塔板/米，而氣相色譜法的柱效能僅為2000塔板/米。高靈敏度：采用高靈敏度的檢測器，進(jìn)一步提高了分析的靈敏度，熒光檢測器可達(dá)10-11g

。高效液相色譜法特點(diǎn)高壓：液體作為流動相流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，施加高HPLC主要知名品牌沃特斯（Waters

安捷倫（Agilent）島津（Shimazu）其它：戴安、菲尼根、熱電等。HPLC主要知名品牌沃特斯（WatersHPLC的特點(diǎn)GC與LC的比較測定對象拓展檢測器不同HPLC的特點(diǎn)GC與LC的比較測定對象拓展檢測器不同高效液相色譜儀液相色譜儀最基本的組件是高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（記錄儀、積分儀或色譜工作站）。此外，還可根據(jù)需要配置流動相在線脫氣裝置、梯度洗脫裝置、自動進(jìn)樣系統(tǒng)、柱后反應(yīng)系統(tǒng)和全自動控制系統(tǒng)等。液相色譜儀的工作過程：輸液泵2將流動相以穩(wěn)定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在色譜柱之前通過進(jìn)樣器3將樣品導(dǎo)入,流動相將樣品帶入色譜柱4,在色譜柱中各組分因在固定相中的分配系數(shù)或吸附力大小的不同而被分離，并依次隨流動相流至檢測器5，檢測到的信號送至數(shù)據(jù)系統(tǒng)6記錄、處理或保存。高效液相色譜儀液相色譜儀最基本的組件是高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色一、高效液相色譜儀流程餾分收集器高壓輸液系統(tǒng)梯度洗脫裝置輔助系統(tǒng)流動相輸送系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)儲液器高壓泵進(jìn)樣器色譜柱檢測器進(jìn)樣器色譜柱檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)一、高效液相色譜儀流程餾分收集器高壓輸液系統(tǒng)梯度洗脫裝置輔流HPLC的基本結(jié)構(gòu)分離部分分析部分控制部分HPLC的基本結(jié)構(gòu)分離部分分析部分控制部分島津LC-20A

見HPLC結(jié)構(gòu)外觀島津LC-20A見HPLC結(jié)構(gòu)外觀Waters機(jī)型Waters機(jī)型Waters機(jī)型Waters機(jī)型Thermofisher液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用Thermofisher液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用大連依利特北京普源精電大連依利特北京普源精電北京北分北京北分上海伍豐上海伍豐江蘇天瑞LC310

江蘇天瑞LC310FL2200浙江福立FL2200浙江福立北京東西分析北京東西分析萊伯泰科HPLC萊伯泰科HPLCHPLC結(jié)構(gòu)的幾種形式串聯(lián)式二元高壓泵系統(tǒng)并聯(lián)式二元高壓泵系統(tǒng)四流路串聯(lián)式單高壓泵系統(tǒng)HPLC的不同類型主要在于高壓輸液泵的區(qū)別。通常有以下幾種形式：HPLC結(jié)構(gòu)的幾種形式串聯(lián)式二元高壓泵系統(tǒng)HPLC的不同類型串聯(lián)式二元高壓泵HPLC結(jié)構(gòu)示意圖串聯(lián)式二元高壓泵HPLC結(jié)構(gòu)示意圖分離部分分離部分由高壓輸液泵、色譜柱及相關(guān)組件組成。由高壓輸液泵吸取流動相，使之進(jìn)入色譜柱，由進(jìn)樣器注入樣品后，由色譜柱進(jìn)行分離。在高壓輸液泵之前常用脫氣機(jī)。在色譜柱部分要裝柱溫箱保持色譜柱的溫度恒定。分離部分分離部分由高壓輸液泵、色譜柱及相關(guān)組件組成。高壓輸液泵目前HPLC配備高壓輸液泵大致有兩種類型：一種是兩個(gè)高壓輸液泵，各自輸送流動相后進(jìn)入混合器。俗稱“二元高壓泵”。另一種是只有一個(gè)高壓輸液泵，在這個(gè)輸液泵之前配備一個(gè)電磁閥控制流路，通常這種形式的泵有四個(gè)流路。俗稱“四元低壓泵”。但其實(shí)質(zhì)上仍是單泵。有一臺安捷倫HPLC和天美HPLC，均為四元低壓的單泵。高壓輸液泵目前HPLC配備高壓輸液泵大致有兩種類型：梯度洗脫2低壓梯度：只需一個(gè)高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比，就是在泵前安裝了一個(gè)比例閥，混合就在比例閥中完成。因?yàn)楸壤y是在泵之前，所以是在常壓（低壓）下混合，在常壓下混合往往容易形成氣泡，所以低壓梯度通常配置在線脫氣裝置。來自于四種溶液瓶的四根輸液管分別與真空脫氣裝置的四條流路相接，經(jīng)脫氣后的四種溶液進(jìn)入比例閥，混合后從一根輸出管進(jìn)入泵體。多元梯度泵的流路可以部分空置。梯度洗脫2低壓梯度：只需一個(gè)高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比高壓輸液泵（外觀）高壓輸液泵（外觀）高壓輸液泵（內(nèi)部）排空閥高壓輸液泵高壓輸液泵（內(nèi)部）排空閥高壓輸液泵高壓泵（一個(gè)，串聯(lián)式）裝電磁閥的部位高壓泵（一個(gè)，串聯(lián)式）裝電磁閥的部位泵傳動的帶齒皮帶泵傳動的帶齒皮帶俯視圖（內(nèi)部）俯視圖（內(nèi)部）高壓輸液泵原理高壓輸液泵原理單向閥實(shí)物單向閥實(shí)物為何有兩個(gè)泵頭，卻只能算是一個(gè)泵？為何有兩個(gè)泵頭，卻只能算是一個(gè)泵？在同一個(gè)軸上有兩個(gè)相位相差180度的偏心輪，當(dāng)其中一個(gè)吸液時(shí)，另一個(gè)排液。交替進(jìn)行。這樣就減少了輸液的脈動。在同一個(gè)軸上有兩個(gè)相位相差180度的偏心輪，當(dāng)其中一個(gè)吸液時(shí)排空閥（Purge閥）起什么作用？排空閥（Purge閥）起什么作用？Purge閥Purge閥主要用于兩個(gè)方面：1剛開機(jī)時(shí)，要打開Purge閥(逆時(shí)針方向擰180度)，啟動高壓輸液泵沖洗約３～5min，排掉一段流動相以去除管腔中的氣泡．2更換不同的流動相時(shí)，要將前面一段流動相排盡。開啟Purge閥時(shí)，一般用較高的流速（5ml/min）來沖洗管腔。Purge閥Purge閥主要用于兩個(gè)方面：混合器混合器混合器混合器高效液相色譜檢測技術(shù)ppt課件混合器的作用混合器主要是用來混勻流動相的。流動相不均勻?qū)z測影響很大?；旌掀魍ǔＪ峭ㄟ^一些U形管來使流動相混勻，即“蛇形管”模式。也有的是采用一些過濾介質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的。由于在混合過程中沒有動力裝置，故稱為“靜態(tài)混合”。此外，好的混合器可使儀器系統(tǒng)壓力比較恒定?；旌掀鞯淖饔没旌掀髦饕怯脕砘靹蛄鲃酉嗟?。島津20AT型HPLC島津20AT型HPLC輸液泵脫氣機(jī)手動進(jìn)樣器柱溫箱差示折光檢測器紫外檢測器混合器輸液泵脫氣機(jī)手動進(jìn)樣器柱溫箱差示折光檢測器紫外檢測器混合器脫氣機(jī)脫氣機(jī)脫氣脫氣原因流動相溶液往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡。氣泡進(jìn)入檢測器后會在色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪音峰。小氣泡慢慢聚集后會變成大氣泡，大氣泡進(jìn)入流路或色譜柱中會使流動相的流速變慢或出現(xiàn)流速不穩(wěn)定，致使基線起伏。氣泡一旦進(jìn)入色譜柱,排出這些氣泡則很費(fèi)時(shí)間。在熒光檢測中,溶解氧還會使熒光淬滅。溶解氣體還可能引起某些樣品的氧化或使溶液pH值發(fā)生變化。方法超聲波振蕩脫氣惰性氣體鼓泡吹掃脫氣真空脫氣裝置脫氣脫氣原因脫氣機(jī)內(nèi)部構(gòu)造脫氣機(jī)內(nèi)部構(gòu)造島津儀器將柱溫箱和手動進(jìn)樣器設(shè)計(jì)為一體。這一設(shè)計(jì)的最大弊端是維護(hù)手動進(jìn)樣器十分不便！島津儀器將柱溫箱和手動進(jìn)樣器設(shè)計(jì)為一體。這一設(shè)計(jì)的最大弊手動進(jìn)樣閥原理手動進(jìn)樣閥實(shí)圖手動進(jìn)樣閥原理手動進(jìn)樣閥實(shí)圖進(jìn)樣前，進(jìn)樣，進(jìn)樣后3個(gè)過程示意圖進(jìn)樣前，進(jìn)樣，進(jìn)樣后3個(gè)過程示意圖高效液相色譜檢測技術(shù)ppt課件柱溫箱柱溫箱是保障色譜柱在恒定的溫度下工作的前提條件，也是HPLC結(jié)果重現(xiàn)性的保障．沒有柱溫箱是很難進(jìn)行定性定量分析的．因?yàn)闇囟瓤捎绊懳镔|(zhì)的保留時(shí)間，峰形等參數(shù)．除制備型HPLC以外，一般分析型HPLC都要有柱溫箱．柱溫箱柱溫箱是保障色譜柱在恒定的溫度下工作的前提條件，也是H國產(chǎn)柱溫箱國產(chǎn)柱溫箱安捷倫自帶的臥式柱溫箱安捷倫自帶的臥式柱溫箱色譜柱色譜柱可分為正相色譜柱、反相色譜柱、特殊專用柱（手性色譜柱、離子色譜柱、氨基酸分析柱、糖類分析柱等）操作儀器前一定要認(rèn)清是什么型號、什么材質(zhì)的色譜柱！否則，亂用流動相，一次就可導(dǎo)致色譜柱報(bào)廢！如：環(huán)糊精為填料的手性色譜柱，如果流動相含有水，即可溶解，一次性報(bào)廢！色譜柱色譜柱可分為正相色譜柱、反相色譜柱、特殊專用柱（手性色反相色譜柱目前最常用的為反相色譜柱。反相色譜柱一般是以硅膠顆料上鍵合C18、C8而成。常用的為C18。C18反相色譜柱適合分離很多物質(zhì)，且色譜柱較為耐用。反相色譜柱目前最常用的為反相色譜柱。C18注意事項(xiàng)但流動相PH值一定要保證在2~8之間。低于２或高于８，色譜柱即遭破壞。反相色譜柱一定不能用純水作流動相，否則鍵合的C18坍塌，報(bào)廢！流動相中水的比例最大為90%。C18注意事項(xiàng)但流動相PH值一定要保證在2~8之間。低于２或液相色譜柱液相色譜柱色譜柱不能震動、跌落！色譜柱不用時(shí)，從儀器上取下后要用適當(dāng)?shù)娜軇┍４?，并在兩端擰上堵頭！紅色部分即為堵頭色譜柱不能震動、跌落！紅色部分即為堵頭如何認(rèn)識不同型號儀器的構(gòu)造？無論何種HPLC，其結(jié)構(gòu)總離不開高壓輸液泵、進(jìn)樣器、柱溫箱、檢測器幾個(gè)部分。搞清儀器不同部分的作用是做好實(shí)驗(yàn)和維護(hù)儀器的前提！如何認(rèn)識不同型號儀器的構(gòu)造？無論何種HPLC，其結(jié)構(gòu)總離不開共用一個(gè)機(jī)箱的串聯(lián)式二元高壓輸液泵

（典型代表是安捷倫）共用一個(gè)機(jī)箱的串聯(lián)式二元高壓輸液泵

安捷倫1200內(nèi)部構(gòu)造安捷倫1200內(nèi)部構(gòu)造二元高壓輸液泵的HPLC（Agilent）二元高壓輸液泵的HPLC（Agilent）并聯(lián)式二元高壓輸液泵這種形式的輸液泵制造工藝要求比串聯(lián)泵更高。Waters公司是以做并聯(lián)泵為主要產(chǎn)品的。島津近期也推出了并聯(lián)泵產(chǎn)品，如：LC-20AD國產(chǎn)HPLC中只有極少數(shù)廠家生產(chǎn)：如：上海伍豐、江蘇天瑞等。并聯(lián)式二元高壓輸液泵這種形式的輸液泵制造工藝要求比串聯(lián)泵更高二元高壓并聯(lián)泵HPLC結(jié)構(gòu)示意圖貯液瓶高壓輸液泵脫氣機(jī)檢測器色譜柱柱溫箱混合器進(jìn)樣器電腦廢液瓶二元高壓并聯(lián)泵HPLC結(jié)構(gòu)示意圖貯液瓶高壓輸液泵脫氣機(jī)檢測器并聯(lián)泵結(jié)構(gòu)的高效液相并聯(lián)泵結(jié)構(gòu)的高效液相四流路單高壓輸液泵的HPLC

（典型代表為安捷倫）四流路單高壓輸液泵的HPLC

（典型代表為安捷倫）二元高壓并聯(lián)泵HPLC結(jié)構(gòu)示意圖貯液瓶高壓輸液泵電磁閥檢測器色譜柱柱溫箱混合器進(jìn)樣器電腦廢液瓶脫氣機(jī)二元高壓并聯(lián)泵HPLC結(jié)構(gòu)示意圖貯液瓶高壓輸液泵電磁閥檢測器安捷倫1100整體結(jié)構(gòu)安捷倫1100整體結(jié)構(gòu)安捷倫1100內(nèi)部構(gòu)造安捷倫1100內(nèi)部構(gòu)造四元低壓單泵的HPLC（Agilent）高壓輸液泵電磁閥（含四個(gè)流路）四元低壓單泵的HPLC（Agilent）高壓輸液泵電磁閥（含分析部分分析部分主要就是由檢測器組成。常用的檢測器有紫外檢測器、差示折光檢測器、熒光檢測器、蒸發(fā)－光散射檢測器等。紫外檢測器最為常用。它又可分為可變波長檢測器（VWD）和二極管陣列檢測器（PDA）。分析部分分析部分主要就是由檢測器組成。紫外檢測器（外觀）紫外檢測器（外觀）紫外檢測器（內(nèi)部）流通池紫外檢測器（內(nèi)部）流通池紫外可見波長檢測器示意圖紫外可見波長檢測器示意圖紫外可見波長檢測器獲得的色譜圖紫外可見波長檢測器獲得的色譜圖光電二極管陣列（DAD）檢測器DAD檢測器仍然屬于紫外檢測器。與普通紫外可見波長檢測器不同的是，它的二極管有512個(gè)，可同時(shí)采集不同波長下的紫外吸收信號。普通紫外可見波長檢測器是先分光，再通過流通池。DAD是混合光先通過流通池，再分光。光電二極管陣列（DAD）檢測器DAD檢測器仍然屬于紫外檢測器光電二極管陣列檢測器（DAD）DAD檢測器光電二極管陣列檢測器（DAD）DADDAD檢測器可作三維色譜圖DAD檢測器可作三維色譜圖DAD檢測器與普通紫外檢測器的對比DAD檢測器能在檢測色譜峰的同時(shí)獲得光譜，便于定性。普通紫外是先分光，再通過流通池，因?yàn)槭菃问?，所以靈敏度高。DAD檢測器是先通過流通池，再分光，因?yàn)槭腔旌瞎?，所以靈敏度低。一般比普通紫外靈敏底低一個(gè)數(shù)量級！DAD檢測器與普通紫外檢測器的對比DAD檢測器能在檢測色譜峰差示折光檢測器（主要用于無紫外吸收的糖類檢測）差示折光檢測器（主要用于無紫外吸收的糖類檢測）控制部分控制部分主要就是工作站。工作站由硬件和軟件兩部分組成。硬件一般是一塊可雙向傳輸數(shù)據(jù)的板卡，安裝于電腦主機(jī)上。軟件則是與相應(yīng)機(jī)型配套的程序。有一些軟件還要一個(gè)“加密狗”，外形類似于U盤。沒有“加密狗”，軟件就不能運(yùn)行?？刂撇糠挚刂撇糠种饕褪枪ぷ髡?。工作站由硬件和軟件兩部分組成HPLC操作注意事項(xiàng)使用HPLC之前必須熟悉相關(guān)基礎(chǔ)知識。包括儀器構(gòu)造、流動相的選擇、色譜柱的保養(yǎng)等。必須經(jīng)過培訓(xùn)方可獨(dú)立操作HPLC操作注意事項(xiàng)使用HPLC之前必須熟悉相關(guān)基礎(chǔ)知識。包做HPLC的“四項(xiàng)基本原則”流動相和樣品必須微孔濾膜過濾！開機(jī)初始一定要排除流動相氣泡！

檢測前一定要平衡儀器！測完樣品一定要沖洗色譜柱！堅(jiān)持這四項(xiàng)基本原則，液相一般不會出現(xiàn)重大問題～做HPLC的“四項(xiàng)基本原則”流動相和樣品必須微孔濾膜過濾！堅(jiān)流動相的選擇不同的液相流動相不同。主要是根據(jù)色譜柱和檢測器來選擇。千萬不要認(rèn)為所有液相的流動相是通用的！以常用的紫外檢測器反相高效液相色譜為例，常用的流動相為甲醇、乙腈及水或緩沖鹽。思考：為何選擇甲醇、乙腈為流動相？流動相的選擇不同的液相流動相不同。主要是根據(jù)色譜柱和檢測器來流動相用緩沖鹽注意事項(xiàng)緩沖鹽易于在柱塞桿上析出，對柱塞桿及柱塞桿密封圈磨損極大，如果沒有及時(shí)清洗，會導(dǎo)到高壓輸液泵漏液！除非萬不得已，盡量不用緩沖鹽。如果要用緩沖鹽，盡量用揮發(fā)性緩沖鹽（如：醋酸－醋酸銨），不要用非揮發(fā)性緩沖鹽（如：磷酸緩沖鹽）。流動相用緩沖鹽注意事項(xiàng)緩沖鹽易于在柱塞桿上析出，對柱塞桿及柱人造寶石材質(zhì)人造寶石材質(zhì)柱塞桿密封圈（俗稱“黑草帽”）柱塞桿密封圈（俗稱“黑草帽”）流動相的過濾流動相必須用0.22um的微孔濾膜過濾．微孔濾膜有兩