循環(huán)腫瘤DNA意義課件

循環(huán)腫瘤DNA的檢測及臨床意義循環(huán)腫瘤DNA的檢測及臨床意義1腫瘤診斷方法血清標(biāo)志物：蛋白類（癌胚抗原，糖類抗原，甲胎蛋白等），核酸類（microRNA,LncRNA）影像學(xué)診斷(超聲，CT，MRI，PET，PET-CT)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulatingtumorcell,CTC）循環(huán)腫瘤DNA（circulatingtumorDNA，ctDNA）腫瘤診斷方法血清標(biāo)志物：蛋白類（癌胚抗原，糖類抗原，甲胎蛋白2循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動的攜帶一定特征（包括突變，缺失，插入，重排，拷貝數(shù)異常，甲基化等）來自腫瘤基因組的DNA片段；來源：1、來自于壞死的腫瘤細(xì)胞；2、來自于凋亡的腫瘤細(xì)胞；3、循環(huán)腫瘤細(xì)胞；4、來自于腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體；含量低，約占整個循環(huán)DNA的1%，甚至只有0.01%。循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動的攜帶3ctDNA發(fā)展簡史1948年首次發(fā)現(xiàn)人體血液中存在著循環(huán)DNA，癌癥患者的循環(huán)腫瘤DNA則發(fā)現(xiàn)于1977年。1994年發(fā)現(xiàn)這些DNA含有癌癥的標(biāo)志性突變，證明其來自于腫瘤。鑒于腫瘤DNA會流入血液，香港中文大學(xué)的盧煜明（DennisLo）教授推測胎兒DNA應(yīng)該也能進(jìn)入血液。1997年證明孕婦血液中攜帶著男性胎兒的Y染色體。該發(fā)現(xiàn)允許醫(yī)生們在懷孕初期通過無創(chuàng)方式檢測胎兒的性別，甚至篩查唐氏綜合癥等發(fā)育疾病。這是產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的一次革命。ctDNA發(fā)展簡史1948年首次發(fā)現(xiàn)人體血液中存在著循環(huán)DN4循環(huán)腫瘤DNA的應(yīng)用腫瘤的早期診斷；腫瘤治療方案確定；腫瘤療效觀察；腫瘤預(yù)后評估；腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險分析；腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測。循環(huán)腫瘤DNA的應(yīng)用腫瘤的早期診斷；5ctDNA優(yōu)勢無創(chuàng)、無損、實(shí)時、多次；當(dāng)不能獲得腫瘤組織信息時，可以開展“液體活檢”；假陽性率低，靈敏度高，準(zhǔn)確度高，可用于腫瘤的早期診斷；能夠?qū)δ[瘤的演化和適應(yīng)性改變進(jìn)行監(jiān)控；能夠?qū)δ[瘤病人的治療效果進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控（尤其在追蹤腫瘤轉(zhuǎn)歸、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等方面），并進(jìn)行個性化的治療方案指導(dǎo)（如個性化靶向藥物用藥，個性化化療等）。

ctDNA優(yōu)勢無創(chuàng)、無損、實(shí)時、多次；6ctDNA如何發(fā)揮診斷、監(jiān)測、預(yù)后評估的功能？循環(huán)DNA水平變化循環(huán)DNA基因修飾變異循環(huán)DNA完整性點(diǎn)突變雜合性缺失微衛(wèi)星不穩(wěn)定性超甲基化ctDNA如何發(fā)揮診斷、監(jiān)測、預(yù)后評估的功能？循環(huán)DNA水平7

研究熱點(diǎn)近10年ctDNA相關(guān)發(fā)表文章數(shù)（pubmed數(shù)據(jù)庫）NEJM：4篇PNAS：7篇JAMA：1篇SciTranslMed：6篇Cancerresearch:12篇ClinCancerRes:28篇研究熱點(diǎn)近10年ctDNA相關(guān)發(fā)表文章數(shù)（pubme8利用數(shù)字PCR檢測640例不同癌癥病人的血漿ctDNA，在超過75%的病人血液中檢測到ctDNA，原發(fā)癌檢出率約為50%。在結(jié)腸癌，胃癌，胰腺癌，乳腺癌中，ctDNA檢出率分別為73%,57%,48%,50%。ctDNA在不同惡性腫瘤中的檢測ctDNA在不同惡性腫瘤中的檢測9

相對于原發(fā)癌，ctDNA在轉(zhuǎn)移癌中檢出率更高，且分期越高，ctDNA檢出率也更高；可用于耐藥突變的檢測；ctDNA是普遍適用的、敏感和特異的標(biāo)志物,可用于不同類型癌癥患者的臨床監(jiān)測。ctDNA在不同惡性腫瘤中的檢測相對于原發(fā)癌，ctDNA在轉(zhuǎn)移癌中檢出率更高，且分期越高，10乳腺癌病人（尤其在轉(zhuǎn)移性乳腺癌）的血漿cfDNA的完整性顯著下調(diào)，而血漿cfDNA的濃度顯著上調(diào)，可作為早期診斷的標(biāo)志物，具有較好的敏感度和特異性。ctDNA應(yīng)用于乳腺癌早期診斷乳腺癌病人（尤其在轉(zhuǎn)移性乳腺癌）的血漿cfDNA的完整性顯著11在30例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者接受系統(tǒng)性治療的不同時間點(diǎn)測定血液中的ctDNA，CA15-3，CTC細(xì)胞的含量，比較三者之間的敏感度。在30例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者接受系統(tǒng)性治療的不同時間點(diǎn)測定血液中12ComparisonofCirculatingTumorDNA,CA15-3,andCirculatingTumorCellsasBlood-BasedBiomarkers.相比于CA15-3和循環(huán)腫瘤細(xì)胞，循環(huán)腫瘤DNA具有更高的靈敏度。ComparisonofCirculatingTumo13ComparisonofCirculatingBiomarkerstoMonitorTumorDynamicsandPredictSurvival.相對于蛋白類診斷標(biāo)志CA15-3及血液中的偱環(huán)腫瘤細(xì)胞，ctDNA在監(jiān)測腫瘤的動態(tài)發(fā)展中具有更高的靈敏度。

血漿中ctDNA的含量與預(yù)后密切相關(guān)，含量越高，病人的5年生存率越低（P<0.001）ctDNA含量的增高及CTC數(shù)目的增加，病人的預(yù)后顯著變差，而CA15-3沒有預(yù)后判斷功能。ComparisonofCirculatingBiom14肝癌病人的血漿中存在兩種不同長度的DNA分子：短鏈DNA分子（<150bp）和長鏈DNA分子（>180bp）；短鏈DNA分子與ctDNA突變率及拷貝數(shù)異常相關(guān)，且與ctDNA濃度正相關(guān)；長鏈DNA分子不攜帶腫瘤相關(guān)ctDNA特征，且與ctDNA濃度負(fù)相關(guān)。肝癌病人的血漿中存在兩種不同長度的DNA分子：短鏈DNA分子15監(jiān)測ctDNA的突變率比監(jiān)測cfDNA濃度，對胃癌動態(tài)發(fā)展的監(jiān)控靈敏度更高。監(jiān)測ctDNA的突變率比監(jiān)測cfDNA濃度，對胃癌動態(tài)發(fā)展的16利用區(qū)域捕獲測序技術(shù)檢測乳腺癌原發(fā)瘤及肝臟轉(zhuǎn)移瘤的基因突變情況，并監(jiān)控血液中ctDNA在治療過程中的動態(tài)變化。利用區(qū)域捕獲測序技術(shù)檢測乳腺癌原發(fā)瘤及肝臟轉(zhuǎn)移瘤的基因突變17

ctDNA在監(jiān)測腫瘤的動態(tài)發(fā)展中具有更高的靈敏度和特異性；

ctDNA能比蛋白類標(biāo)志物CA15-3更早的預(yù)測腫瘤動態(tài)發(fā)展情況。ctDNA在監(jiān)測腫瘤的動態(tài)發(fā)展中具有更高的靈敏度和特異性；18ctDNA檢測技術(shù)ctDNA檢測技術(shù)19ctDNA檢測技術(shù)標(biāo)本種類：血漿提取方法：商品化試劑盒檢測方法：PCR、基因測序ctDNA檢測技術(shù)標(biāo)本種類：血漿20數(shù)字PCR將一個標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個反應(yīng)器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板)，實(shí)現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò)增”，擴(kuò)增結(jié)束后，通過陽性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。陰性微滴比例推算起始靶分子的絕對量泊松分布一個待分析的PCR反應(yīng)體系成千上萬個獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系:靶標(biāo)分子:有限稀釋●:陽性微滴（1）○:陰性微滴（0）泊松分布PCR擴(kuò)增優(yōu)點(diǎn)：可絕對定量，靈敏度可達(dá)單個核酸分子，檢測限低至0.001%；缺點(diǎn)：只能檢測已知的突變位點(diǎn)，通量低；ctDNA檢測技術(shù)數(shù)字PCR將一個標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每21標(biāo)記擴(kuò)增深度測序（TAM-Seq）突變頻率檢出率可達(dá)2%；敏感性和特異性高于97%；成本較低，利于臨床應(yīng)用。癌癥個體化深度測序(CAPP-Seq)對腫瘤的ctDNA檢測靈敏度高；特異性強(qiáng)；與全外顯子測序等相比經(jīng)濟(jì)可行。ctDNA檢測技術(shù)BEAMing技術(shù)結(jié)合數(shù)字PCR與流式技術(shù)；定量分析，靈敏度高；特異的突變可以通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離