菌種保藏技術(shù)-菌種遺傳與變異

基因重組的概念：來(lái)自兩個(gè)不同細(xì)胞的基因（DNA）所發(fā)生的轉(zhuǎn)移和結(jié)合稱為基因重組。基因的轉(zhuǎn)移和重組大大增加了生物的遺傳多樣性。在微生物中，基因的傳遞可以使病毒將遺傳信息傳給細(xì)菌，使細(xì)菌致病性得以提高以及細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性等。另一方面人為的控制微生物的基因轉(zhuǎn)移和重組的研究成果有助于解決農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學(xué)問(wèn)題以及預(yù)防和治療傳染病的難題。本項(xiàng)目將介紹微生物基因轉(zhuǎn)移和重組的四種現(xiàn)象和機(jī)制。轉(zhuǎn)化受體菌直接吸收來(lái)自供體菌的DNA片段，通過(guò)交換將其整合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)化。通過(guò)轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代，稱為轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化因子指有轉(zhuǎn)化活性的外源DNA片段，它是供體菌釋放或人工提取的游離DNA片段。圖6.5轉(zhuǎn)化過(guò)程示意圖

接合

接合是通過(guò)供體菌和受體菌的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過(guò)程。

細(xì)菌的接合現(xiàn)象在大腸桿菌中研究的最清楚。大腸桿菌有性別分化，決定它們性別的因子稱為F因子。F因子是一種質(zhì)粒，在大腸桿菌中每個(gè)細(xì)胞含有約1～4個(gè)F因子。F因子既可脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，也可整合到染色體組上；它既可經(jīng)過(guò)接合作用而獲得，也可通過(guò)一些理化因素(如吖啶橙、絲裂霉素、利福平、溴化乙錠和加熱等)的處理而從細(xì)胞中消除。含有F因子的大腸桿菌稱為F＋菌株，不含有F因子的大腸桿菌稱為F－菌株。

F＋菌株可以與不含F(xiàn)因子的F－菌株接合，從而使后者也成為F＋菌株。其過(guò)程大體可分兩個(gè)階段：首先是F＋菌株與F－菌株配對(duì)，并通過(guò)性菌毛接合；然后F因子雙鏈DNA的一條單鏈在一特定的位置斷開(kāi)，通過(guò)性菌毛內(nèi)腔向F－菌株細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，并同時(shí)在兩個(gè)菌株細(xì)胞內(nèi)以一條DNA單鏈為模板，各自復(fù)制合成完整的F因子。F＋和F－接合示意圖轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)缺陷噬菌體的媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)胞中，通過(guò)交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得部分新遺傳性狀的重組細(xì)胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象是由J.Lederberg等(1952年)首先在鼠傷寒沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)的。以后在許多原核微生物中都陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)導(dǎo)，如大腸桿菌屬，芽孢桿菌屬，變形桿菌屬，假單胞菌屬，志賀氏菌屬和葡萄球菌屬等。轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象在自然界中比較普通，它在低等生物進(jìn)化過(guò)程中很可能是一種產(chǎn)生新基因組合的重要方式。一、普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)

通過(guò)極少數(shù)完全缺陷噬菌體對(duì)供體菌基因組上任何小片段DNA進(jìn)行“誤包”，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。噬菌體侵入寄主細(xì)胞后，通過(guò)復(fù)制和合成，亦將寄主DNA降解為許多小片段，進(jìn)入裝配階段。正常情況下，噬菌體將自身的DNA包裹在衣殼中，但也有異常的可能。它誤將寄主細(xì)胞DNA的某一片段包裹進(jìn)去。這樣的噬菌體稱缺陷噬菌體。體內(nèi)僅含有供體DNA的缺陷噬菌體稱完全缺陷噬菌體。體內(nèi)同時(shí)含有供體DNA和噬菌體DNA的缺陷噬菌體稱為部分缺陷噬菌體。這種異常情況出現(xiàn)的概率很低（10-5～10-8)。由于噬菌體產(chǎn)生子代數(shù)量很多，所以這種異常情況的出現(xiàn)還是很多的。當(dāng)包裹有寄主DNA片段的噬菌體釋放后，再度感染新的寄主，其中的供體菌的DNA片段進(jìn)入受體菌，并通過(guò)基因重組使受體菌形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。二、局限轉(zhuǎn)導(dǎo)

局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)指通過(guò)部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。最初于1954年在大腸桿菌K12中發(fā)現(xiàn)。它只能轉(zhuǎn)導(dǎo)一種或少數(shù)幾種基因（一般為位于附著點(diǎn)兩側(cè)的基因）。原生質(zhì)體融合

通過(guò)人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過(guò)程，稱為原生質(zhì)體融合。由此法獲得的重組子，稱為融合子。原核生物原生質(zhì)體融合研究是從20世紀(jì)70年代后期才發(fā)展起來(lái)的一種較有效的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移手段。

原生質(zhì)體融合的主要操作步驟是：先選擇兩株有特殊價(jià)值，并帶有選擇性遺傳標(biāo)記的細(xì)胞作為親本菌株置于等滲溶液中，用適當(dāng)?shù)拿摫诿福ㄈ缂?xì)菌和放線菌可用溶菌酶等處理，真菌可用蝸牛消化酶或其他相應(yīng)酶處理）去除細(xì)胞壁，再將形成的原生質(zhì)體（包括球狀體）進(jìn)行離心聚集，加入促融合劑PEG(聚乙二醇)或借電脈沖等因素促進(jìn)融合，然后用等滲溶液稀釋，再涂在能促使它再生細(xì)胞壁和進(jìn)行細(xì)胞分裂的基本培養(yǎng)基平板上。待形成菌落后，再通過(guò)影印平板法，把它接種到各種選擇性培養(yǎng)基平板上，檢驗(yàn)它們是否為穩(wěn)定的融合子，最后再測(cè)定其有關(guān)生物學(xué)性狀或生產(chǎn)性能。參見(jiàn)圖6.8、6.9。圖6.9原生質(zhì)體融合顯微觀察謝謝基因突變的概念基因突變是指遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生的可遺傳的變化。俠義的突變專指點(diǎn)突變，所謂點(diǎn)突變是指一個(gè)基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變，包括一對(duì)或少數(shù)幾對(duì)堿基的缺失、插入或置換，而導(dǎo)致的遺傳變化。廣義的突變包括點(diǎn)突變和染色體畸變，染色體畸變是指大段染色體的缺失、重復(fù)、倒位、易位。在微生物中，點(diǎn)突變是最常見(jiàn)、最易發(fā)生的一種突變現(xiàn)象。從自然界分離到的菌株一般稱野生型菌株，或稱野生型。野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株，稱突變株?；蛲蛔兊念愋?.營(yíng)養(yǎng)缺陷型某一野生型菌株因發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長(zhǎng)因子、堿基或氨基酸的能力，因而無(wú)法在基本培養(yǎng)基（MM）上正常生長(zhǎng)繁殖的變異類型，稱為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。它們可在加有相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基本培養(yǎng)基平板上選出。它的基因型常用所需營(yíng)養(yǎng)物的前三個(gè)英文小寫斜體字母表示，例如hisC、tryA分表代表組氨酸缺陷型和色氨酸缺陷型，其中的大寫字母C和A表示同一表型中不同基因的突變。相應(yīng)的表型則用HisC和TrgA表示。常用hisC-和hisC+分別表示缺陷型和野生型。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳工程和育種等工作中十分有用。2.抗性突變型抗性突變型是指野生型菌株因發(fā)生基因突變，而產(chǎn)生的對(duì)某化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性變異類型，它們可在加有相應(yīng)藥物或用相應(yīng)物理因子處理的培養(yǎng)基平板上選出。抗性突變型普遍存在，例如對(duì)一些抗生素具抗藥性的菌株等。這類突變類型常用所抗藥物的前三個(gè)小寫斜體英文字母加上“r”表示，如：strr和strs分別表示對(duì)鏈霉素的抗性和敏感性。在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長(zhǎng)，所以抗性突變型菌株在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳育種和遺傳工程等研究中極其重要。

基因突變類型3.條件致死突變型某菌株或病毒經(jīng)基因突變后，在原本可以生長(zhǎng)、繁殖的條件下卻無(wú)法生長(zhǎng)、繁殖，這種突變類型稱為條件致死突變型。其中最常用的是溫度敏感條件致死突變株，用ts（temperature-sensitive)表示，這類突變株在特定溫度（28～35℃）下能夠增殖，在非特定溫度（37～40℃）下則不能生長(zhǎng)、繁殖，而野生型在兩種溫度均能增殖。顯然是由于在非特定溫度下，突變基因所編碼的蛋白缺乏其應(yīng)有功能。選育病毒ts株是制備疫苗的重要方法，現(xiàn)已從許多動(dòng)物病毒中分離出ts株，選擇遺傳穩(wěn)定性良好的品系用于制備減毒活疫苗，如流感病毒及脊髓灰質(zhì)炎病毒ts株疫苗。另外還通過(guò)條件致死突變株來(lái)研究那些生長(zhǎng)繁殖所必須的基因。4.形態(tài)突變型形態(tài)突變型是指由突變引起的個(gè)體或菌落形態(tài)的變異。例如，細(xì)菌的鞭毛或莢膜的有無(wú)，霉菌或放線菌的孢子有無(wú)或顏色變化，菌落表面的光滑、粗糙以及噬菌斑的大小、清晰度等的突變。5.抗原突變型抗原突變型是指由于基因突變引起的細(xì)胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生的變異類型，包括細(xì)胞壁缺陷變異（L型細(xì)菌等）、莢膜或鞭毛成分變異等。6.其它突變型如毒力、糖發(fā)酵能力、代謝產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量以及對(duì)某種藥物的依賴性等的突變型。基因突變的機(jī)制:基因突變的原因是多種多樣的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的。一、自發(fā)突變

自發(fā)突變是指生物體在無(wú)人工干預(yù)下自然發(fā)生的低頻率突變。隨誘變機(jī)制的研究，對(duì)自發(fā)突變的原因已有所認(rèn)識(shí)，下面討論幾種自發(fā)突變的可能機(jī)制。1、背景輻射和環(huán)境因素的誘變

不少“自發(fā)突變”實(shí)質(zhì)上是由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素長(zhǎng)期的綜合效應(yīng)導(dǎo)致。例如充滿宇宙空間的各種短波輻射、高溫的誘變效應(yīng)以及自然界中普遍存在的一些低濃度的誘變物質(zhì)的作用等。2、微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變

過(guò)氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物，它對(duì)脈孢菌具有誘變作用。這種作用可因同時(shí)加入過(guò)氧化氫酶而降低，如果同時(shí)再加入過(guò)氧化氫酶抑制劑，則又可提高突變率。這就說(shuō)明，過(guò)氧化氫可能是自發(fā)突變中的一種內(nèi)源誘變劑。在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能也是同樣的原因。

3、由DNA復(fù)制過(guò)程中堿基配對(duì)錯(cuò)誤引起

據(jù)統(tǒng)計(jì)，DNA鏈每次復(fù)制中，每個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)誤配對(duì)的頻率是10-7～10-11，而一個(gè)基因平均約含1000bp，故自發(fā)突變頻率約為10-6。因此，若對(duì)細(xì)菌做一般液體培養(yǎng)時(shí)，因其細(xì)胞濃度?？蛇_(dá)到108個(gè)/ml，故經(jīng)常會(huì)在其中產(chǎn)生自發(fā)突變株?；蛲蛔兊囊?guī)律1、不對(duì)應(yīng)性

即突變的性狀與引起突變的原因間無(wú)直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。例如，細(xì)菌在有青霉素的環(huán)境下，出現(xiàn)了抗青霉素的突變體；在紫外線的作用下，出現(xiàn)了抗紫外線的突變體；在較高的培養(yǎng)溫度下，出現(xiàn)了耐高溫的突變體等。從表面上看，會(huì)認(rèn)為正是由于青霉素、紫外線或高溫的“誘變”，才產(chǎn)生了相對(duì)應(yīng)的突變性狀。事實(shí)恰恰相反，這類性狀都可通過(guò)自發(fā)的或其他任何誘變因子誘發(fā)得到。這里的青霉素、紫外線或高溫僅是起著淘汰原有非突變型(敏感型)個(gè)體的作用。

2、自發(fā)性

由于自然界環(huán)境因素的影響和微生物內(nèi)在的生理生化特點(diǎn)，在沒(méi)有人為誘發(fā)因素的情況下，各種遺傳性狀的改變可以自發(fā)地產(chǎn)生。3、稀有性

指自發(fā)突變的頻率較低，而且穩(wěn)定，一般在10-6～10-9

間。4、獨(dú)立性

突變的發(fā)生一般是獨(dú)立的，即在某一群體中，既可發(fā)生抗青霉素的突變型，也可發(fā)生抗鏈霉素或任何其他藥物的抗藥性。某一基因的突變，即不提高也不降低其他任何基因的突變率。突變不僅對(duì)某一細(xì)胞是隨機(jī)的，且對(duì)某一基因也是隨機(jī)的。5、可誘變性

通過(guò)各種物理、化學(xué)誘變劑的作用，可提高突變率，一般可提高10～105倍。6、穩(wěn)定性

由于突變的根源是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)上發(fā)生了穩(wěn)定的變化，所以產(chǎn)生的新性狀也是穩(wěn)定的和可遺傳的。7、可逆性

由原始的野生型基因變異為突變型基因的過(guò)程稱為正向突變，相反的過(guò)程則稱為回復(fù)突變。實(shí)驗(yàn)證明，任何性狀既有可能正向突變，也有可能發(fā)生回復(fù)突變，兩者發(fā)生的頻率基本相同。謝謝一、菌種的衰退（一）菌種衰退的現(xiàn)象

菌種衰退（degeneration）是指由于自發(fā)突變的結(jié)果，而使某物種原有的一系列生物學(xué)性狀發(fā)生量變或質(zhì)變的現(xiàn)象。菌種衰退的具體表現(xiàn)有以下幾個(gè)方面。

1.菌落和細(xì)胞形態(tài)改變每一種微生物在一定的培養(yǎng)條件下都有一定的形態(tài)特征，如果典型的形態(tài)特征逐漸減少，就表現(xiàn)為衰退。例如，涇陽(yáng)鏈霉菌“5406”的菌落原來(lái)為凸形變成了扇形、帽形或小山形；孢子絲由原來(lái)螺旋形變成波曲形或直形，孢子從橢圓形變成圓柱形等。2.生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少

例如，“5406”的菌苔變薄，生長(zhǎng)緩慢（半個(gè)月以上才長(zhǎng)出菌落），不產(chǎn)生豐富的橘紅色的孢子層，有時(shí)甚至只長(zhǎng)些黃綠色的基內(nèi)菌絲。

3.代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力的下降，即出現(xiàn)負(fù)突變

例如，黑曲霉糖化力、放線菌抗生素發(fā)酵單位的下降以及各種發(fā)酵代謝產(chǎn)物量的減少等，在生產(chǎn)上是十分不利的。

4.致病菌對(duì)宿主侵染能力下降

例如白僵菌對(duì)宿主致病能力的降低等。

5.對(duì)外界不良條件（包括低溫、高溫或噬菌體侵染等）抵抗能力的下降等

例如抗噬菌體菌株變?yōu)槊舾芯甑?。（二）菌種衰退的原因

菌種衰退不是突然發(fā)生的，而是從量變到質(zhì)變的逐步演變過(guò)程。開(kāi)始時(shí)，在群體細(xì)胞中僅有個(gè)別細(xì)胞發(fā)生自發(fā)突變（一般均為負(fù)變），不會(huì)使群體菌株性能發(fā)生改變。經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代，群體中的負(fù)變個(gè)體達(dá)到一定數(shù)量，發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)群體，從而使整個(gè)群體表現(xiàn)為嚴(yán)重的衰退。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因有以下幾方面。

1.基因突變菌種衰退的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變，則表現(xiàn)為產(chǎn)量下降；如果控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變，則產(chǎn)生孢子的能力下降。菌種在移種傳代過(guò)程中會(huì)發(fā)生自發(fā)突變。雖然自發(fā)突變的頻率很低（一般為10-6～10-9），尤其是對(duì)于某一特定基因來(lái)說(shuō)，突變頻率更低。但是由于微生物具有極高的代謝繁殖能力，隨著傳代次數(shù)增加，衰退細(xì)胞的數(shù)目就會(huì)不斷增加，在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢(shì)，最終成為一株衰退了的菌株。表型延遲現(xiàn)象也會(huì)造成菌種衰退。例如在誘變育種過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)某菌株初篩時(shí)產(chǎn)量較高，進(jìn)行復(fù)篩時(shí)產(chǎn)量卻下降了。質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種衰退的情況在抗生素生產(chǎn)中較多，不少抗生素的合成是受質(zhì)粒控制的。當(dāng)菌株細(xì)胞由于自發(fā)突變或外界條件影響（如高溫），致使控制產(chǎn)量的質(zhì)粒脫落或者核內(nèi)DNA和質(zhì)粒復(fù)制不一致，即DNA復(fù)制速度超過(guò)質(zhì)粒，經(jīng)多次傳代后，某些細(xì)胞中就不具有對(duì)產(chǎn)量起決定作用的質(zhì)粒，這類細(xì)胞數(shù)量不斷提高達(dá)到優(yōu)勢(shì)，則菌種表現(xiàn)為衰退。2.連續(xù)傳代連續(xù)傳代是加速菌種衰退的一個(gè)重要原因。一方面，傳代次數(shù)越多，發(fā)生自發(fā)突變（尤其是負(fù)突變）的概率越高；另一方面，傳代次數(shù)越多，群體中個(gè)別的衰退型細(xì)胞數(shù)量增加并占據(jù)優(yōu)勢(shì)越快，致使群體表型出現(xiàn)衰退。3.不適宜的培養(yǎng)和保藏條件不適宜的培養(yǎng)和保藏條件是加速菌種衰退的另一個(gè)重要原因。不良的培養(yǎng)條件如營(yíng)養(yǎng)成分、溫度、濕度、pH、通氣量等和保藏條件如營(yíng)養(yǎng)、含水量、溫度、氧氣等，不僅會(huì)誘發(fā)衰退型細(xì)胞的出現(xiàn)，還會(huì)促進(jìn)衰退細(xì)胞迅速繁殖，在數(shù)量上大大超過(guò)正常細(xì)胞，造成菌種衰退。（三）菌種衰退的防止根據(jù)菌種衰退原因的分析,可以制定出一些防治衰退的措施，主要從以下幾方面考慮。1.控制傳代次數(shù)意即盡量避免不必要的移種和傳代，將必要的傳代降低到最低限度，以減少自發(fā)突變的發(fā)生率。一套良好的菌種保藏方法可大大減少不必要的移種和傳代次數(shù)。2.創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造一個(gè)適合原種的良好培養(yǎng)條件，可以防止菌種衰退。如培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株時(shí)應(yīng)保證適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)成分，尤其是生長(zhǎng)因子；培養(yǎng)一些抗性菌時(shí)應(yīng)添加一定濃度的藥物于培養(yǎng)基中,使回復(fù)的敏感型菌株的生長(zhǎng)受到抑制，而生產(chǎn)菌能正常生長(zhǎng)；控制好碳源、氮源等培養(yǎng)基成分和pH、溫度等培養(yǎng)條件，使之有利于正常菌株生長(zhǎng)，限制退化菌株的數(shù)量，防止衰退。例如，利用菟絲子的種子汁培養(yǎng)“魯保一號(hào)”真菌可防止其退化；在赤霉素生產(chǎn)菌藤倉(cāng)赤霉的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天冬酰胺，谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等豐富營(yíng)養(yǎng)物時(shí)，也有防止菌種衰退的效果；此外，將培養(yǎng)棲土曲霉（Aspergillusterricola）3.942的溫度從28℃～30℃提高到33℃～34℃，可防止其產(chǎn)孢子能力的衰退。3.利用不易衰退的細(xì)胞移種傳代在放線菌和霉菌中，由于它們的菌絲細(xì)胞常含幾個(gè)細(xì)胞核，甚至是異核體，因此用菌絲接種就會(huì)出現(xiàn)不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時(shí)，就不會(huì)發(fā)生這種現(xiàn)象。在實(shí)踐中，若用滅過(guò)菌的棉團(tuán)輕巧地對(duì)放線菌進(jìn)行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達(dá)到了防止衰退的效果；另外，有些霉菌（如構(gòu)巢曲霉）若用其分生孢子傳代就易衰退，而改用子囊孢子移種則能避免衰退。（三）菌種衰退的防止4.采用有效的菌種保藏方法有效的菌種保藏方法是防止菌種衰退的極其必要的措施。在實(shí)踐中，應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性的選擇菌種保藏的方法。例如，啤酒釀造中常用的釀酒酵母，保持其優(yōu)良發(fā)酵性能最有效的保藏方法是-70℃低溫保藏，其次是4℃低溫保藏，若采用對(duì)于絕大多數(shù)微生物保藏效果很好的冷凍干燥保藏法和液氮保藏法，其效果并不理想。一般斜面冰箱保藏法只適用于短期保藏，而需要長(zhǎng)期保藏的菌種，應(yīng)當(dāng)采用砂土管保藏法、冷凍干燥保藏法及液氮保藏法等方法。對(duì)于比較重要的菌種，盡可能采用多種保藏方法。工業(yè)生產(chǎn)用菌種的主要性狀都屬于數(shù)量性狀，而這類性狀恰是最易衰退的。即使在較好的保藏條件下，還是存在這種情況。例如鏈霉素產(chǎn)生菌——灰色鏈霉菌的菌種保藏即使是用冷凍干燥保藏法等現(xiàn)今較好的方法，還是會(huì)出現(xiàn)這類情況。由此說(shuō)明有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌種的衰退。5.講究菌種選育技術(shù)在菌種選育時(shí)，應(yīng)盡量使用單核細(xì)胞或孢子，并采用較高劑量使單鏈突變而使另一單鏈喪失作為模板的能力，避免表型延遲現(xiàn)象。同時(shí)，在誘變處理后應(yīng)進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證菌種的純度。6.定期進(jìn)行分離純化定期進(jìn)行分離純化，對(duì)相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行檢查，也是有效防止菌種衰退的方法。此方法將在菌種復(fù)壯部分介紹。二、菌種的復(fù)壯（一）復(fù)壯概念

從菌種衰退的本質(zhì)可以看出，通常在已衰退的菌種中存在有一定數(shù)量尚未衰退的個(gè)體。狹義的復(fù)