控制菌及螨類檢查技術-藥品中大腸菌群檢查

項目九控制菌檢查及螨類檢查技術任務5藥品中大腸菌群檢查知識點5藥品中大腸菌群檢查方法5.1大腸菌群大腸菌群(Coliform)是指37℃生長時能發(fā)酵乳糖，在2h內產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性、氧化酶陰性、需氧或兼性厭氧的無芽孢桿菌。符合上述定義的細菌除大腸埃希菌屬(

Escherichia)的多數(shù)菌外，還包括腸桿菌科的腸桿菌屬(

Enterobacter)、枸櫞酸菌屬(

Citrobacter)、克雷伯菌屬(Ablh)的多數(shù)菌。大腸菌群包括了正常人畜腸道內需氧的大多數(shù)革蘭陰性桿菌。以大腸菌群作為衛(wèi)生指示菌比控制大腸埃希菌具有廣泛的衛(wèi)生學意義，檢查方法簡便。因此，國際上以大腸菌群作為藥品、食品、飲水等的衛(wèi)生指示菌，對衛(wèi)生質量的要求更嚴格。藥品中大腸菌群檢查方法大腸菌群細菌在水、土壤、空氣中常見，它是人和動物腸道中主要的菌叢，常通過糞便和動物的活動污染水和環(huán)境，同時也帶來致病污染的危險。有人用糞便污染土壤后，在不同時間(1～2個月)檢查土壤中大腸埃希菌的存活情況。結果隨著時間的增加，大腸埃希菌的存活率降低，而產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷菌的檢出率逐漸增加。說明大多數(shù)大腸埃希菌不能適應外界環(huán)境而死亡，少部分大腸埃希菌在外界環(huán)境的影響下逐漸變成的產(chǎn)氣腸桿菌或陰溝腸桿菌、肺炎克雷菌。由此表明：在樣本中檢出大腸埃希菌，表明樣本受糞便的近期污染；如同時檢出產(chǎn)氣腸桿菌或陰溝腸桿菌、肺炎克雷菌，表明樣本受糞便的近期污染和遠期污染。大腸菌群的檢查通過增菌、分離、革蘭染色鏡檢和確證試驗等步驟。藥品中大腸菌群檢查方法5.2檢查程序5.2.1增菌培養(yǎng)

取不少于10m膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，加入1:10供試液1ml(含供試品0.1g或0.1ml);1:100稀釋的供試液1ml(含供試品0.01g或0.01ml)和1:1000稀釋的供試液1ml(含供試品0.001g或0.001ml)。取1支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基10ml管，加入稀釋劑1ml作為陰性對照。均培養(yǎng)18-24h，觀察結果。加供試液的膽鹽乳糖發(fā)酵管若無菌生長，或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則判該管未檢出大腸菌群。若膽鹽乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則進一步分離培養(yǎng)。5.2.2分離培養(yǎng)

將上述產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中的培養(yǎng)物，分別劃線接種于曙紅亞甲基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)18～24h。藥品中大腸菌群檢查方法大腸菌群的菌落在紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基平板上呈紫黑、紫紅，紅或粉紅色，圓形，偏平或凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤：在麥康圓瓊脂培養(yǎng)基平板上呈鮮桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，若平板上無菌落生長，或生長的菌落與上述菌落特征不符或為非革蘭陰性無芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群：若平板上生長有上述菌落形態(tài)特征或疑似菌落，且為革蘭陰性無芽孢桿菌，應進行確證試驗。5.2.3確證試驗

從上述分離平板上挑選4～5個疑似菌落，接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)24-48h、若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該膽鹽乳糖發(fā)酵管檢出大腸需群，否則判未檢出大腸菌群（見下表）。藥品中大腸菌群檢查方法最可能的大腸菌群數(shù)藥品中大腸菌群檢查方法各供試品量的檢出結果最可能的大腸菌群數(shù)1.0g或1.0ml0.1g或.0.1ml0.01g或0.01ml+++﹥102++-10﹤N﹤102+--1﹤N﹤10---﹤15.3注意事項5.3.1加供試液的乳糖膽鹽發(fā)酵管，由于有的藥渣顏色較深或沉淀物較多，干擾結果的觀察。應仔細觀察倒管底部或試管壁、培養(yǎng)液表面有無氣泡。5.3.2乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基內的倒管不小于30mmx3mm(內徑)。否則，倒管被藥渣遮擋，不便觀察結果。5.3.3加供試液的乳糖膽鹽發(fā)醇管，經(jīng)培養(yǎng)后，其倒管內無論產(chǎn)氣多少，均應做分離培養(yǎng)，革蘭染色、鏡檢。如產(chǎn)氣太少，可延長培養(yǎng)時間。5.3.4盡可能多挑選EMB或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上大腸菌群可疑菌落，做乳糖發(fā)酵確證試驗。挑可疑菌落越多，可提高大腸菌群檢出率。藥品中大腸菌群檢查方法項目九控制菌檢查及螨類檢查技術任務5藥品中大腸菌群檢查技能點2藥品中大腸菌群檢查試驗操作規(guī)程1.實訓目的掌握大腸菌群的檢查程序及注意事項。2.實訓要求2.1能按照下達的任務要求，完成大腸菌群檢查的試驗設計。2.2能根據(jù)試驗設計完成試驗的準備及試驗的具體操作。2.3能根據(jù)試驗反應的結果做出正確的結論。3.實驗原理一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來源于人、畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價產(chǎn)品的衛(wèi)生質量，推斷產(chǎn)品中有否有污染腸道致病菌的可能。藥品中大腸菌群檢查試驗操作規(guī)程4.儀器及設備恒溫培養(yǎng)箱、玻璃平板或一次性無菌平板、多頭濾器及配套設施、濾膜（0.45μm）、鑷子、高壓滅菌鍋、牛皮紙、棉繩、橡皮筋、冰箱

、塑料瓶、酒精燈、

三角瓶、橡皮塞、超凈工作臺、取樣袋、75%酒精、無菌蒸餾水5.培養(yǎng)基和試劑5.1培養(yǎng)基：大腸菌群顯色培養(yǎng)基制備：根據(jù)供應商提供的說明書，攪拌加熱煮沸至完全溶解，不要高壓蒸汽滅菌，不要過度加熱。待培養(yǎng)基冷卻至47±2℃，分裝至平板，厚度為4mm。倒置冰箱保存。5.2氧化酶試紙5.3酵母浸膏培養(yǎng)基（無葡萄糖PCA）或胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）藥品中大腸菌群檢查試驗操作規(guī)程6.操作步驟:6.1過濾及培養(yǎng)6.1.1灼燒過濾頭除菌，使用無菌鑷子將濾膜貼放于已冷卻的過濾頭上，安裝濾杯。在CCA平板上記錄相關信息。6.1.2過濾前充分搖晃，混勻待測樣品，將待測樣品倒入濾杯中。6.1.3

使用無菌鑷子小心轉移濾膜至CCA培養(yǎng)基，無菌操作。6.1.4將平板倒置于36±2℃培養(yǎng)21-24小時藥品中大腸菌群檢查試驗操作規(guī)程6.2結果判讀6.2.1分別計數(shù)不同類型的菌落，根據(jù)下表對菌落進行驗證：

注：NA表示不適用藥品中大腸菌群檢查試驗操作規(guī)程CCA瓊脂上的菌落類型氧化酶試驗紫羅蘭色菌落NA粉紅色菌落√其他類型菌落NA(1)所有紫羅蘭色菌落均確認為大腸埃希氏菌，不需要進行氧化酶試驗。(2)部分CCA平板上可能出現(xiàn)藍綠色菌落，這部分菌落不應該記錄為大腸菌群或大腸桿菌。(3)對粉紅色的菌落，證實試驗是必須的。

6.3驗證試驗6.3.1氧化酶試驗挑取至少10個菌落進行該試驗(如果總的粉紅色菌落少于10個,則應挑取全部菌落進行試驗),可直接挑取CCA平板上的菌落進行氧化酶測試,但務必注意,粉紅色菌落本身帶有顏色,淺紅色或無色均被認為是陰性結果。紫紅色才被認為是陽性結果。禁止使用鐵質或鎳鉻絲接種環(huán)。藥品中大腸菌群檢查試驗操作規(guī)程6.4分離純化試驗6.4.1TSA劃線如果由于菌落太小，或者菌落之間太近存在融合，則使用接種環(huán)小心挑取部分菌落，劃線接種在TSA培養(yǎng)基上。倒置于36±2℃培養(yǎng)22±2H，然后再挑取單菌落進行氧化酶試驗。7.結果報告大腸菌群的結果=（紫羅蘭色的菌落數(shù)+確認為