社區(qū)感染產(chǎn)金屬酶銅綠假單胞菌主要基因型調(diào)查

社區(qū)感染產(chǎn)金屬酶銅綠假單胞菌主要基因型調(diào)查

銅綠假單胞菌是一種條件菌株，是引起社區(qū)感染的主要病原體之一。其對多種抗菌藥物表現(xiàn)為天然耐藥和獲得性耐藥,加之近年來抗生素、免疫抑制劑、腫瘤化療等藥物的廣泛應(yīng)用,多重耐藥和泛耐藥銅綠假單胞菌的數(shù)量不斷上升,已成為臨床抗感染治療的一大難題,目前對社區(qū)感染耐亞胺培南銅綠假單胞菌的有關(guān)研究甚少。本文為收集到具有代表性菌株,故選擇相隔較遠(yuǎn)的三家醫(yī)院作研究對象,對38株社區(qū)感染耐亞胺培南銅綠假單胞菌進(jìn)行金屬酶情況和主要的基因型檢測,結(jié)果報(bào)告如下。11.1來源：蘑菇1.1.1菌株感染或種植史參照2005年美國疾病預(yù)防與控制中心(CDC)鑒別標(biāo)準(zhǔn):門急診或入院后48h內(nèi)的分離菌株;無亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌(imipenemresistantpseudomonasaeruginosa,IRPA)感染或種植史,1年內(nèi)無住院或與護(hù)理機(jī)構(gòu)、收容所、托兒所等機(jī)構(gòu)接觸史;無透析、手術(shù)或留置導(dǎo)尿及其他穿刺醫(yī)療操作裝置1.1.2本實(shí)驗(yàn)菌株的基因文明2010年1月至2012年6月廣州醫(yī)學(xué)院荔灣醫(yī)院、廣州市番禺區(qū)沙灣人民醫(yī)院和增城市朱村街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心三家醫(yī)院臨床微生物室技術(shù)人員負(fù)責(zé)收集臨床資料及標(biāo)本,將符合社區(qū)感染診斷標(biāo)準(zhǔn)的銅綠假單胞菌,保存于-40℃冰箱中備用。質(zhì)控菌株:大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853購于廣東省臨檢中心;產(chǎn)MBL(IMP-1型和VIM-2型)銅綠假單胞菌的陽性對照菌株由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院惠贈(zèng)。1.2藥物、試劑與儀器40SI全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏檢測系統(tǒng)(美國DadeBehring),BCD-200HC型普通冰箱(中國華凌),ZKV-L200-4超低溫冰箱(日本Sanyo),生物安全柜(江蘇安泰),抗菌藥物紙片、M-H瓊脂(英國Oxoid),PCR儀器(Biometra,德國),凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司),各種靶基因引物合成及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序由上海生工生物工程有限公司完成。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)結(jié)果使用MicroScanWalkAway40SI全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏檢測系統(tǒng)及紙片擴(kuò)散法(K-B法)測定,按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。1.3.2表中的模型檢測采用改良三維試驗(yàn)法檢測IRPA的MBL表型1.3.3pcr擴(kuò)增采用煮沸法提取細(xì)菌DNA后,用PCR對IMP-1和VIM-2金屬酶基因進(jìn)行擴(kuò)增,IMP-1引物序列:上游5′-CTACCGCAGCAGAGTCTTTG-3′,下游5′-AACCAGTTTTGCCTTACCAT3′;VIM-2引物序列:上游5′-ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG-3′,下游5′-CTACTCAACGACTGAGCG-3′。PCR反應(yīng)體系:總體積為25μL,正、反向引物(10μmol/L)各1μL,2×PCRTaqMix12.5μL,DNA模板1μL,去離子水9.5μL;PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃3min,變性94℃30s,退火55℃30s,延伸72℃60s,共30個(gè)循環(huán),最后延伸72℃5min,DNAMarker為DL2000;PCR產(chǎn)物長度IMP-1為587bp,VIM-2為801bp,用1.5%瓊脂糖凝膠對產(chǎn)物電泳,電壓90V/cm,電泳40min后用溴化乙錠染色20min,清水沖洗,拍照記錄結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序,結(jié)果在GenBank網(wǎng)上查詢。1.4統(tǒng)計(jì)方法運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,率的比較采用χ22.1醫(yī)院和社區(qū)對irpa的感染情況比較社區(qū)感染銅綠假單胞菌檢出395例,亞胺培南耐藥38例(9.6%),醫(yī)院感染銅綠假單胞菌檢出482例,亞胺培南耐藥106例(22.0%),社區(qū)感染IRPA明顯低于醫(yī)院感染(2.2產(chǎn)金酶表型篩選實(shí)驗(yàn)改良三維試驗(yàn)檢測社區(qū)感染亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬酶情況,38株IRPA檢出7株MBL陽性,檢出率為18.4%。2.3需要3株凝膠電泳檢測金屬酶對7株產(chǎn)金屬酶表型陽性銅綠假單胞菌用IMP-1和VIM-2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測,凝膠電泳顯示3株為VIM-2型金屬酶(圖1~2)。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序,測序結(jié)果登陸GenBank()比對。3加強(qiáng)藥藥使用管理銅綠假單胞菌在自然界分布廣泛,常存在于正常人皮膚、呼吸道和消化道等處,在機(jī)體防御系統(tǒng)出現(xiàn)損傷后引起感染,是社區(qū)和醫(yī)院感染的主要條件致病菌之一。全國2006—2007年度非發(fā)酵革蘭陰性菌中銅綠假單胞菌臨床分離率居首位(45.3%)金屬β-內(nèi)酰胺酶是一組依賴少數(shù)金屬離子(主要為Zn金屬酶有很多基因型,已發(fā)現(xiàn)的金屬酶基因有IPM、VIM、SPM、SIM和GIM型五大家族本次研究結(jié)果表明,社區(qū)感染IRPA占9.6%,有必要加強(qiáng)抗菌藥物使用監(jiān)管,尤其是高速增長的藥品零售企