細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)課件

細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)1.細(xì)胞分離（cellseparation）(1)制備單一細(xì)胞懸液組織

EDTA細(xì)胞間連接

消化

胰酶細(xì)胞外基質(zhì)多細(xì)胞懸液1.細(xì)胞分離（cellseparation）(1)制備(2)分離不同類型細(xì)胞A.離心（centrifugation）

大小密度形狀

小輕不規(guī)則大重圓形(2)分離不同類型細(xì)胞A.離心（centrifugatB.細(xì)胞的黏附性C.親和性表面①②

輕微震蕩消化基質(zhì)B.細(xì)胞的黏附性C.親和性表面①②輕微震蕩D.流式細(xì)胞儀(flowcytometer,FCM)

熒光激活細(xì)胞分選儀（FACS）

原理：

用帶有熒光的特異抗體標(biāo)記待分離的細(xì)胞，然后在流式細(xì)胞儀中選出標(biāo)記細(xì)胞。D.流式細(xì)胞儀(flowcytometer,FCM)

應(yīng)用：細(xì)胞分選:1cellin10005000cells/sec應(yīng)用：細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)課件E.激光捕捉顯微切割技術(shù)

(Lasercapturemicrodissection,LCM)原理：應(yīng)用：從組織切片中獲取單一細(xì)胞E.激光捕捉顯微切割技術(shù)

(Lasercapturem2.細(xì)胞培養(yǎng)（Cellculture）從活體組織分離出特定細(xì)胞,在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng),使之能夠繼續(xù)生存、生長(zhǎng)以至增殖的一種方法。

invivo：用動(dòng)物做實(shí)驗(yàn)

invitro：用培養(yǎng)細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)

2.細(xì)胞培養(yǎng)（Cellculture）細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)課件(1)細(xì)胞培養(yǎng)的條件A.固體表面B.培養(yǎng)基、血清C.無(wú)菌、抗生素D.37℃、5％CO2

、95～100％濕度

(1)細(xì)胞培養(yǎng)的條件A.固體表面(2)細(xì)胞培養(yǎng)的不同階段

原代培養(yǎng)(primaryculture)

傳代培養(yǎng)(secondaryculture)傳代細(xì)胞系（Cellline）成功篩選細(xì)胞株（cellstrain）(2)細(xì)胞培養(yǎng)的不同階段傳代細(xì)胞系（Cellline）成功原代培養(yǎng)(primaryculture):直接從生物體獲取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)(secondaryculture)：將原代培養(yǎng)的細(xì)胞連續(xù)以一定比例擴(kuò)大培養(yǎng)。細(xì)胞系(cellline)：原代培養(yǎng)細(xì)胞成功傳代即為細(xì)胞系。細(xì)胞株（cellstrain）：從培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。原代培養(yǎng)(primaryculture):直接從生物體獲取

功能：保持原分化特性形態(tài)：多不保持原有細(xì)胞形態(tài)成纖維樣細(xì)胞上皮樣細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的特點(diǎn)：功能：保持原分化特性培養(yǎng)細(xì)胞的特點(diǎn)：（１）變異細(xì)胞

可無(wú)限增殖、傳代

細(xì)胞系（NIH3T3:1963年由小鼠成纖維細(xì)胞建立）接觸抑制:細(xì)胞系在固體表面生長(zhǎng)繁殖,在互相接觸后,即培養(yǎng)皿長(zhǎng)滿一單層細(xì)胞后停止分裂、增殖。細(xì)胞系的來(lái)源：（１）變異細(xì)胞細(xì)胞系的來(lái)源：

（２）由癌細(xì)胞建立的“癌細(xì)胞系”

特點(diǎn):可在培養(yǎng)皿中以極高的密度增殖，沒(méi)有擴(kuò)展的余地時(shí),可向空間生長(zhǎng)。（３）正常細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)建立的“轉(zhuǎn)化細(xì)胞系”腫瘤病毒放射線化學(xué)致癌物用癌基因轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞（２）由癌細(xì)胞建立的“癌細(xì)胞系”(3)細(xì)胞克?。–ellcloning）克?。╟lone）：指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。

群體培養(yǎng)（massculture）：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合(confluence)后形成均勻的單細(xì)胞層；

克隆培養(yǎng)（clonalculture）：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆。(3)細(xì)胞克?。–ellcloning）克?。╟lone）(4)細(xì)胞融合(4)細(xì)胞融合①定義在自然或人工條件下，使二個(gè)或二個(gè)以上細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。①定義在自然或人工條件下，使二個(gè)或二個(gè)以

生物學(xué)方法：仙臺(tái)病毒化學(xué)方法：PEG(聚乙二醇)

物理方法：電脈沖打孔儀②促融方法②促融方法③應(yīng)用A.細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間的相互作用

雞紅細(xì)胞組織培養(yǎng)細(xì)胞融合紅細(xì)胞開(kāi)始合成RNA,并進(jìn)行DNA復(fù)制③應(yīng)用A.細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間的相互作用細(xì)胞周期相關(guān)因子的發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期相關(guān)因子的發(fā)現(xiàn)B.膜蛋白流動(dòng)性C.基因定位B.膜蛋白流動(dòng)性C.基因定位D.單克隆抗體制備

（monoclonalantibody）

單一的抗原一個(gè)B淋巴細(xì)胞特異性抗體單克隆抗體定義:

從單個(gè)B淋巴細(xì)胞繁殖的細(xì)胞克隆可以得到均質(zhì)的抗體叫單克隆抗體。D.單克隆抗體制備

（monoclonalantibody制備過(guò)程：1984年Nobel獎(jiǎng)

B淋巴細(xì)胞＋“不死的”小鼠骨髓瘤細(xì)胞

雜交細(xì)胞（雜交瘤）

B淋巴細(xì)胞(產(chǎn)生特異性抗體)

腫瘤細(xì)胞(在體外無(wú)限增殖)將每個(gè)雜交瘤細(xì)胞分別增殖，就得到很多單一細(xì)胞的克隆，一個(gè)克隆可以產(chǎn)生一種特異性單克隆抗體。制備過(guò)程：1984年Nobel獎(jiǎng)B淋巴細(xì)胞＋“不死的”細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)課件三、細(xì)胞組分的分級(jí)分離三、細(xì)胞組分的分級(jí)分離1.超速離心—

細(xì)胞器、大分子

1.超速離心—細(xì)胞器、大分子制備細(xì)胞勻漿細(xì)胞勻漿液膜細(xì)胞器大分子

方法：●低滲透壓●超聲振蕩●在細(xì)胞膜上打孔●強(qiáng)制通過(guò)微孔●機(jī)械破碎或研磨制備細(xì)胞勻漿細(xì)胞膜方法：●低滲透壓細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)課件⑴.差速離心法:用于分離大小、形狀顯著不同

的組分，根據(jù)顆粒沉降速度不同得以分離.⑴.差速離心法:用于分離大小、形狀顯著不同

的組分⑵.速度沉降用途:分離密度相近而大小形狀略有差異的組分原理：制備梯度離心介質(zhì),分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。梯度特點(diǎn):梯度平緩，密度較低(5%-20%)，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。分離效率:取決于沉降系數(shù)間的差異。⑵.速度沉降用途:分離密度相近而大小形狀略有差異的組分細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)課件細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)課件⑶.平衡沉降用途：分離大小、形態(tài)相似而密度不同的組分。

原理：制備梯度離心介質(zhì)，樣品各成分在梯度介質(zhì)中經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的成分分離。特點(diǎn)：介質(zhì)密度高，陡度大(20%-70%）介質(zhì)最低密度大于被分離組分的最大密度。分離效率:取決于浮力密度間的差異。⑶.平衡沉降用途：分離大小、形態(tài)相似而密度不同的組分。細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)課件細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)課件2.非細(xì)胞體系由分級(jí)分離得到的具有生物功能的細(xì)胞抽提物。

舉例：

1.線粒體、葉綠體

2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

3.蛋白質(zhì)合成體系2.非細(xì)胞體系由分級(jí)分離得到的具有生物功能3.層析—

分離蛋白質(zhì)(1)分配層析紙層析薄層層析3.層析—分離蛋白質(zhì)(1)分配層析⑵柱層析

—

分離蛋白質(zhì)⑵柱層析—分離蛋白質(zhì)A.離子交換層析B.凝膠過(guò)濾層析

電荷大小A.離子交換層析B.凝膠過(guò)濾C.親和層析D.疏水性層析

親和疏水性

基質(zhì)＋抗體基質(zhì)＋疏水基團(tuán)C.親和層析D.疏⑶高壓液相層析(HPLC）基質(zhì)粒度小分辨率高分離速度快⑶高壓液相層析(HPLC）基質(zhì)粒度小4.電泳—

分析蛋白質(zhì)、核酸

(1)原理氨基酸帶有正、負(fù)電荷，因此蛋白質(zhì)往往帶有凈正電荷或負(fù)電荷。將含有蛋白質(zhì)的溶液加上電場(chǎng)，蛋白質(zhì)分子就會(huì)按照它們的凈電荷的多少、大小及形狀的不同在電場(chǎng)中移動(dòng)，這一技術(shù)稱為電泳。

4.電泳—分析蛋白質(zhì)、核酸(1)原理大小電荷形狀(2)SDS

—

根據(jù)蛋白質(zhì)分子量、亞單位組成*

樣品處理:SDS(十二烷基硫酸鈉)2-巰基乙醇(2-ME)/二硫蘇糖醇(DTT)*支持體:單體丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝膠*染色:考馬斯亮藍(lán)特異性蛋白(westernblotting)√大小電荷形狀(2)SDS-PA細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)課件細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)課件

Western印跡技術(shù)將經(jīng)聚丙稀酰胺凝膠分離的蛋白帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,然后將膜與特異性抗體作用,膜上特定蛋白條帶將與抗體結(jié)合,并進(jìn)一步與酶標(biāo)記二抗反應(yīng),最終以發(fā)色底物顯色而被檢測(cè).

基本步驟:(1)SDS(2)轉(zhuǎn)膜

(3)抗體反應(yīng)一抗孵育標(biāo)記二抗孵育

(4)顯色Western印跡技術(shù)⑶等電聚焦電泳⑶等電聚焦電泳⑷.雙向電泳—蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)原理：等電聚焦:等電點(diǎn)

SDS:分子量⑷.雙向電泳—蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)原理：等電聚焦:等電點(diǎn)細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)課件5.質(zhì)譜技術(shù)原理：通過(guò)測(cè)定樣品離子的質(zhì)/荷比來(lái)進(jìn)行成分和結(jié)構(gòu)分析的方法。應(yīng)用：蛋白質(zhì)鑒定（2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者）5.質(zhì)譜技術(shù)原理：通過(guò)測(cè)定樣品離子的質(zhì)/荷比（2002年諾貝四.細(xì)胞內(nèi)分子的示蹤技術(shù)

四.細(xì)胞內(nèi)分子的示蹤技術(shù)

1.同位素示蹤技術(shù)——放射自顯影術(shù)

(autoradiography)

將放射性前體物質(zhì)摻入細(xì)胞，使放射性分子和細(xì)胞內(nèi)原有的未標(biāo)記分子混和，因它們的化學(xué)性質(zhì)相同,細(xì)胞就會(huì)不加分辨地利用。1.同位素示蹤技術(shù)——放射自顯影術(shù)

●放射性化合物滲入活細(xì)胞●培養(yǎng)后取樣、固定,進(jìn)行光鏡或電鏡切片●在暗處把感光乳膠覆蓋于切片上，存放在暗處●在此期間,放射性同位素衰變使乳膠曝光后顯影及定影。根據(jù)銀粒所在部位，就可知道細(xì)胞中放射性物質(zhì)的分布。具體操作過(guò)程

●放射性化合物滲入活細(xì)胞具體操作過(guò)程A.細(xì)胞內(nèi)生物大分子的定性、定位

與半定量

蛋白質(zhì)——放射性同位素標(biāo)記的

氨基酸

核酸——放射性同位素標(biāo)記的

堿基A.細(xì)胞內(nèi)生物大分子的定性、定位

與半定量蛋白質(zhì)—舉例：⑴分泌蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位①將胰島β細(xì)胞與3H-亮氨酸共同孵育5分鐘，②用未標(biāo)記的亮氨酸沖洗。③在暗處把感光乳膠覆蓋在切片上存放數(shù)日。④放射性同位素衰變使乳膠感光，經(jīng)過(guò)顯影和定影，根據(jù)感光乳膠黑色銀顆粒所在位置即可知道細(xì)胞中放射物質(zhì)的分布情況。舉例：⑴分泌蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位①將胰島β細(xì)胞與3H-亮氨酸共舉例：⑵大腸桿菌DNA結(jié)構(gòu)的證明舉例：⑵大腸桿菌DNA結(jié)構(gòu)的證明B.示蹤細(xì)胞中幾乎所有的過(guò)程對(duì)放射性分子在細(xì)胞內(nèi)存在部位和化學(xué)形式進(jìn)行追蹤，就可測(cè)定放射性分子進(jìn)入細(xì)胞后不同時(shí)間所在的位置和化學(xué)變化（光合作用）。B.示蹤細(xì)胞中幾乎所有的過(guò)程對(duì)放射性分子在細(xì)胞內(nèi)存在部位和化舉例：⑴分泌蛋白在細(xì)胞內(nèi)合成、運(yùn)輸及分泌舉例：⑴分泌蛋白在細(xì)胞內(nèi)合成、運(yùn)輸及分泌舉例：⑵DNA和RNA在細(xì)胞內(nèi)合成過(guò)程用3H-胸苷、3H-尿苷滲入細(xì)胞

DNA在細(xì)胞核中合成RNA在細(xì)胞核中合成并保留在核內(nèi)很快累積于細(xì)胞質(zhì)中舉例：⑵DNA和RNA在細(xì)胞內(nèi)合成過(guò)程用3H-胸苷、3H-尿

2.抗體示蹤技術(shù)A.抗體+熒光素LM(免疫熒光顯微鏡)

2.抗體示蹤技術(shù)A.抗體+熒光素LM(免疫B.抗體+膠體金EM(免疫電鏡)B.抗體+膠體金EM(免疫電鏡)C.ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay)

抗體＋酶酶酶底物顯色C.ELISA(enzyme-linkedimmunos五、分子生物學(xué)技術(shù)五、分子生物學(xué)技術(shù)1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—克隆DNA片斷

(polymerasechainreaction，PCR)

（1）反應(yīng)體系：模板鏈

DNA聚合酶

dNTP

引物（primer）（2）反應(yīng)步驟：變性95℃

退火45℃～65℃

延伸72℃1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—克隆DNA片斷

(polymera2.核酸電泳2.核酸電泳3.核酸分子雜交—精確檢測(cè)特定核苷酸序列

原理：堿基互補(bǔ)配對(duì)探針（probe