基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討保元湯治療擴(kuò)張型心肌病的作用機(jī)制

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討保元湯治療擴(kuò)張型心肌病的作用機(jī)制

擴(kuò)張性心肌?。╟dm）是一種以左心室或雙室心腔增大和心肌收縮功能降低為主要特征的心肌疾病。這是各種心臟疾病的“最終共同經(jīng)歷”，也是導(dǎo)致心力衰竭最常見的心肌病的“最終途徑”。根據(jù)DCM的臨床表現(xiàn)及病程演變，可歸屬為中醫(yī)“喘證”“心悸”“水腫”“心水證”“心衰”等范疇，其病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛包括氣、血、陰、陽虧虛，而氣虛是該病最早期表現(xiàn)，也是該病最根本病機(jī)1材料和方法1.1保元湯活性成分篩選借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP,http：///tcmsp.php）檢索保元湯中各單味藥的所有化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度（OB)>30%及類藥性（DL)>0.18條件篩選保元湯的活性成分。對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫未收錄的肉桂，通過中藥分子作用機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM,http：///batman-tcm/index.php）進(jìn)行檢索，以綜合評(píng)分≥20、P<0.5為條件進(jìn)行初步篩選，得到相應(yīng)的活性成分后在TCMSP中以O(shè)B>30%及DL>0.18為條件進(jìn)一步篩選。此外，結(jié)合文獻(xiàn)檢索補(bǔ)充保元湯組方藥材中的有效活性成分。利用Pubchem數(shù)據(jù)庫（https：///）下載每一個(gè)活性成分的2D結(jié)構(gòu)（sdf格式），并將其上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），選擇物種為“Homosapiens”，預(yù)測(cè)化合物的靶蛋白。對(duì)于Pubchem數(shù)據(jù)庫中未收錄的化合物，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取活性成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白。將所有預(yù)測(cè)的靶蛋白映射到Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：///），以校正為通用的靶基因名。利用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建“保元湯成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。1.2dcm作用靶點(diǎn)的獲取基于GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：///）、在線《人類孟德爾遺傳》數(shù)據(jù)庫（OMIM,https：///omim），以“dilatedcardiomyopathy”為檢索詞獲取DCM的作用靶點(diǎn)。通過微生信網(wǎng)站（http：///）獲取藥物與疾病的共同靶點(diǎn)，即保元湯治療DCM潛在作用靶點(diǎn)。1.3“寶源湯成分、cdm目標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)建設(shè)1.4蛋白-蛋白相互作用將“1.2”項(xiàng)下獲得的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：///），選擇物種為“Homosapiens”，設(shè)置Mediumconfidence>0.4，分析蛋白相互作用關(guān)系，以tsv格式保存結(jié)果。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過“NetworkAnalyzer”工具對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算所有節(jié)點(diǎn)的Degree值的中位數(shù)，選擇Degree大于2倍中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，提取Hithubs網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)接近中心性（ClosenessCentrality）、介數(shù)（BetweennessCentrality）、Degree值篩選Hub基因。1.5同靶基因的轉(zhuǎn)換通過R4.0.3軟件安裝“RSQLite”及“BiocManager”包，將共同靶基因轉(zhuǎn)換為entrezID格式，并保存為id.txt文件。利用R4.0.3軟件，分別安裝來源于BiocManager的“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”包，以及“colorspace”“stringi”包1.6體外蛋白配體的設(shè)計(jì)以Hithubs網(wǎng)絡(luò)中度值排名前7位的Hub靶基因作為受體蛋白，從PDB數(shù)據(jù)庫（https：///）中下載其3D結(jié)構(gòu)（pdb格式），運(yùn)用PyMOL軟件對(duì)受體蛋白進(jìn)行去水、加氫、刪除磷酸根、移除原始配體等操作，保存新受體蛋白及原始配體。以篩選出來的保元湯主要活性化合物及臨床有效治療DCM的藥物為小分子配體，從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：///）下載配體的2D結(jié)構(gòu)（sdf格式），用ChemBio3DUltra14.0打開，優(yōu)化力學(xué)結(jié)構(gòu)，另存為mol2格式文件。利用AutoDockTools1.5.6將配體及受體轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，尋找每一個(gè)受體蛋白的活性口袋，運(yùn)行AutoDockvina1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接2結(jié)果2.1mol002靶基因通過TCMSP平臺(tái)、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索，除去沒有相應(yīng)靶點(diǎn)及重復(fù)項(xiàng)后，共篩選到保元湯活性成分120個(gè)，其中黃芪17個(gè)，肉桂1個(gè)，人參19個(gè)，甘草90個(gè)。kaempferol（山柰酚，MOL000422,B1）是黃芪、人參、甘草共有的成分；isorhamnetin（異鼠李素，MOL000354,A5）、Jaranol（華良姜素，MOL000239,A4）、quercetin（槲皮素，MOL000098,A3）、Calycosin（毛蕊異黃酮，MOL000417,A2）、formononetin（刺芒柄花素，MOL000392,A1)5個(gè)活性成分是黃芪、甘草共有的。通過SwissTargetPrediction、TCMSP、Uniprot數(shù)據(jù)庫篩重后得到892個(gè)靶基因，見表1。利用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建“保元湯成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。2.2共同基因的獲得通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索，合并去重后共獲得960個(gè)靶基因，通過微生信網(wǎng)站將其與保元湯靶基因進(jìn)行映射，獲得91個(gè)共同基因，見圖2。2.3“寶源湯成分、dm目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)”的構(gòu)建和可視化分析2.4中心節(jié)點(diǎn)度值通過String數(shù)據(jù)庫及Cytoscape3.8.2軟件，構(gòu)建保元湯與DCM共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖4）及Hithubs網(wǎng)絡(luò)（見圖5）。PPI網(wǎng)絡(luò)中有89個(gè)節(jié)點(diǎn)（去掉2個(gè)游離靶點(diǎn)）、883條邊，中位自由度值為16，黃色中心節(jié)點(diǎn)為度值大于2倍中位數(shù)的靶點(diǎn)，綠色中心節(jié)點(diǎn)為度值排名前7位的靶點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)的大小與度值大小呈正相關(guān)，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值越大，其在網(wǎng)絡(luò)中就發(fā)揮著越多的生物功能。Hithubs網(wǎng)絡(luò)中自由度值前7位的靶點(diǎn)為：絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3，度值59）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子α（VEGFA，度值55）、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1，度值51）、表皮生長(zhǎng)因子（EGFR，度值48）、腫瘤蛋白P53(TP53，度值47）、胱天蛋白酶3(CASP3，度值45）、腫瘤壞死因子（TNF，度值45），基于此，預(yù)測(cè)上述靶點(diǎn)是保元湯治療DCM的Hub靶基因。2.5go基因生物過程通過對(duì)91個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG富集分析，篩選出102個(gè)GO條目，152條KEGG通路。根據(jù)P值及GeneRatio值大小篩選出排名前20位的GO功能（見圖6）及KEGG通路（見表3）。圖6中，縱坐標(biāo)表示GO功能條目，橫坐標(biāo)表示富集在GO條目上的基因數(shù)占共同靶點(diǎn)的比例。由表3可知，交集靶點(diǎn)主要富集在癌癥中的蛋白聚糖、MAPK信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、乙型肝炎、cAMP信號(hào)通路、癌癥中的MicroRNA、PI3K-Akt信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗等通路。由圖6可知，涉及的生物功能主要包括蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、內(nèi)肽酶活性、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、信號(hào)受體激活物的活性、蛋白C末端結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等生物過程。利用R4.0.3軟件中的pathview包繪制保元湯治療DCM的通路圖。圖7為MAPK信號(hào)通路，涉及22個(gè)保元湯治療DCM的靶點(diǎn)，其中有17個(gè)Hithubs網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)，說明保元湯治療DNC的核心靶點(diǎn)散在分布于這條通路中。2.6分子定位一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，結(jié)合作用越大3保元湯治療dcm的關(guān)鍵活性成分及靶點(diǎn)分析擴(kuò)張型心肌病（DCM）的主要病理生理特征包括能量代謝異常、心肌肥大、細(xì)胞凋亡及心肌纖維化等本研究結(jié)果顯示，保元湯治療DCM的主要活性物質(zhì)包括：五味子酯乙、花生四烯酸、脫氧三尖杉酯堿、格里西輪、異黃烷酮、槲皮素、原花青素B1等。已有研究也表明，五味子酯乙具有保護(hù)心肌線粒體KEGG富集分析結(jié)果顯示，保元湯治療DCM是多通路、多機(jī)制的結(jié)果。在現(xiàn)有研究中，MAPKs、PI3K-Akt、cGMP-PKG等通路與DCM的發(fā)病密切相關(guān)。MAPKs信號(hào)通路廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，通過ERK、JNK、p38MAPK及ERK5/BMK1等途徑綜上所述，保元湯通過不同活性物質(zhì)的協(xié)同作用，可從保護(hù)心肌線粒體、調(diào)節(jié)心肌能量代謝、調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡及自噬、抑制心肌纖維化等方面發(fā)揮治療DCM的作用。本研究提示的保元湯治療DCM的相關(guān)活性物質(zhì)、靶點(diǎn)以及信號(hào)通路，部分已被基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，說明該研究方法的準(zhǔn)確性及實(shí)用性，而未被證實(shí)的靶點(diǎn)及通路可作為理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步揭示其分子機(jī)制的研究提供方向。利用軟件中“”工具對(duì)保元湯活性成分和治療DCM的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治觯Y選出保元湯治療DCM的關(guān)鍵活性成分及靶點(diǎn)，并構(gòu)建“保元湯-成分-DCM-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。運(yùn)用Cytoscape3.8.2構(gòu)建“保元湯-成分-DCM-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖3。圖中包含206個(gè)節(jié)點(diǎn)（Node),1133條邊（Edge），邊表示節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，這充分體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值（degree）表示網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)直接相互作用的節(jié)點(diǎn)的數(shù)目。一個(gè)