水產(chǎn)品新鮮度化學(xué)指標(biāo)的檢測-吲哚的測定

吲哚的測定——分光光度法原理一試劑與儀器二分析步驟三目錄頁結(jié)果表述四吲哚是蝦產(chǎn)品中重要的腐敗代謝物，是由蛋白質(zhì)中色氨酸經(jīng)細(xì)菌脫羧酶的作用分解產(chǎn)生，蝦產(chǎn)品從新鮮到腐敗的變化范圍內(nèi)，吲哚含量呈正相關(guān)變化，其測定方法有高效液相色譜法和分光光度法等。吲哚一、原理樣品中的吲哚隨水蒸氣蒸餾蒸出用三氮甲烷萃取，加顯色劑振搖，分離出酸層，以乙酸定容，用分光度計測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。二、試劑與儀器1.試劑（1）飽和硫酸鈉溶。（2）顯色劑:對二甲氨基苯甲醛。

顯色劑的配制:溶解0.4g對二甲氨基苯甲醛于5mL乙酸中，加92mL磷酸和3mL鹽酸混勻。（3）吲哚標(biāo)準(zhǔn)液:精確稱取20mg吲哚，加乙醇溶解，定容至200mL。其濃度為0.10mg/mL,4℃貯存在冰箱內(nèi)。二、試劑與儀器2.儀器（1）分光光度計。（2）蒸餾裝置:使用單獨的蒸汽發(fā)生器。蒸汽發(fā)生器可由1000mL錐形瓶制成。用最短的膠皮管與全玻璃蒸汽蒸餾瓶連接，蒸餾瓶容量應(yīng)在500mL以上，用500mL錐形瓶作接收器(沒有保護(hù)層的天然或合成橡膠連接器和塞，會產(chǎn)生不同的蒸餾空白)。2.儀器（3）電子天平:感量為0.01g和0.1mg。（4）分液編斗:125mL.和500mL。（5）均質(zhì)器。（6）容量瓶:50mL。三、分析步驟1.試樣的制備

取500g代表性的樣品。在室溫下解凍，待樣品全部融化后破碎(蝦干樣品直接破碎)，將試樣均分成兩份，分別裝入樣品瓶中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記。一份作為試驗樣，另一份在18℃以下保存。2.提取稱取試樣25g~50g(取決于所預(yù)計的吲哚量)(蝦干稱取試樣12.5g~25g，并加人等量水浸潤2h)，移至均質(zhì)器中，量取80mL乙醇，加入燒杯中，以3000r/min的速度均質(zhì)5min。轉(zhuǎn)入蒸餾瓶中，用少量乙醇沖洗均質(zhì)器，加5滴消泡劑。將蒸餾瓶和蒸汽發(fā)生器連接，緩慢地供應(yīng)蒸汽至開始蒸餾（通入蒸汽不可太猛以免產(chǎn)生過多泡沫）。給熱汽發(fā)生器提供足夠的熱量，控制蒸汽發(fā)生器，使蒸餾瓶內(nèi)保持80mL~90mL的體積，約45min內(nèi)在接受瓶內(nèi)收集約450mL餾出液，用少量乙醇沖洗蒸餾瓶，并入接收瓶中。將餾出液移至500mL分液漏斗中，加入5mL稀鹽酸和5mL飽和硫酸鈉溶液。依次用25mL、20mL和15mL三氯甲烷提取，每次用力振搖1min，放氣靜置分層，先將25mL和20mL三氯甲燒提取液合并到到另一500mL分液漏斗中，依次加入400mL水5mL飽和硫酸鈉溶液和5mL稀鹽酸洗滌，保留洗滌液，通過脫脂棉將合并的是取液濾入干燥的125mL分液漏斗中。再用同一洗滌液洗滌15mL三氯甲烷提取液，將三氯甲烷合并入同一125mL分液漏斗中。3.測定加入10mL顯色劑于合并的三氯甲烷提取液中，用力振搖2min，放氣靜置，使酸層盡可能地分層。取8.0mL酸層轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，用乙酸稀釋定容，混勻。移取該溶液于分光光度計比色池中，在560m處測定吸光度A。將8.0mL顯色劑用乙酸稀釋定容至50mL.混勻，測定空白。

通過蒸汽蒸餾一組新制備的吲哚標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別移取1mL、2mL、3mL、4mL和5mL按樣品測定程序制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，不加吲哚標(biāo)準(zhǔn)工作液，按同樣方法測定蒸餾空白。四、結(jié)果表述按公式計算樣品中吲哚含量：式中：X——試樣中吲哚含量，單位為微克每千克(μg/kg)；A——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的吲哚量，單位為微克(μg)；m——最終測試樣液所代表的樣品量，單位為克(g)。吲哚的測定——高效液相色譜法原理一試劑與儀器二分析步驟三目錄頁結(jié)果表述四吲哚是蝦產(chǎn)品中重要的腐敗代謝物，是由蛋白質(zhì)中色氨酸經(jīng)細(xì)菌脫羧酶的作用分解產(chǎn)生，蝦產(chǎn)品從新鮮到腐敗的變化范圍內(nèi)，吲哚含量呈正相關(guān)變化，其測定方法有高效液相色譜法和分光光度法等。吲哚一、原理試樣經(jīng)乙腈超聲提取、稀釋后直接采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。二、試劑與儀器1.試劑（1）標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：稱取50mg吲哚標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈

溶解定容至50mL，配制溶液濃度1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備

溶液，1℃~4℃冰箱避光保存，有效期1周。（2）標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：用乙腈稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液

至濃度為10μg/mL，1℃~4℃冰箱避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。（3）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用乙腈配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。（4）內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：稱取50mg吲哚標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解定容至50mL，配制溶液濃度1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，1℃~4℃冰箱避光保存。（5）內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制：用乙腈稀釋內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至濃度為10μg/mL，1℃~4℃冰箱避光保存。二、試劑與儀器2.儀器（1）高效液相色譜儀，配有熒光檢測器。（2）電子天平：感量為0.01g和0.1mg。（3）旋渦混勻器。（4）超聲波清洗機。（5）離心機：5000r/min。（6）容量瓶：50mL.（7）具塞塑料離心管：聚丙烯，50mL.三、分析步驟1.試樣的制備取500g代表性的樣品。在室溫下解凍，待樣品全部融化后破碎(蝦干樣品直接破碎)，將試樣均分成兩份，分別裝入樣品瓶中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記。一份作為試驗樣，另一份在-18℃以下保存。稱取5g試樣（蝦干稱取2.5g樣品，并加入2.5mL水浸潤2h）于50mL具塞離心管中，臘入250μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，加入20mL乙腈、渦旋混合1min。室溫下避光超聲10min，離心(4700r/min，3min)，液體部分轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，殘渣再加入20mL乙腈重復(fù)提取一次，合開提取液，加乙腈定容至50mL，混勻，過0.22μm濾膜，供高效液相色譜儀測定。3.測定（1）液相色譜條件液相色譜條件如下：色譜柱：C-18柱（ODS-2），250mm×4.6mm（內(nèi)徑），5μm，或相當(dāng)者；流動相：乙腈/水（65+35），等度洗脫流速：1mL/min;熒光檢測器波長：激發(fā)波長λex=270nm，發(fā)射波長λex=340nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。（2）色譜測定根據(jù)試樣中被測樣液的含量，選定濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測物的響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)，對標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣液等體積參插進(jìn)樣測定。以2-甲基吲哚為內(nèi)標(biāo)物，以吲哚和2-甲基吲哚的峰面積比值為縱坐標(biāo)，以吲哚的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用保留時間定性，內(nèi)標(biāo)法定量，得到樣液中吲哚的濃度。4.空白實驗除不加樣品外，按樣品測定步驟進(jìn)行。四、結(jié)果表