pwax柱固相萃取-高效液相色譜法檢測食品中多種合成著色劑

pwax柱固相萃取-高效液相色譜法檢測食品中多種合成著色劑

食品中使用的八種合成色胺是由焦油從焦油中分離得到的，屬于偶氮化合物。合成著色劑測定方法有高效液相色譜(HPLC)法、薄層色譜法、示波極譜法等,因HPLC的普及,該方法被廣泛使用。國標(biāo)及文獻報道1材料和方法1.1合成陰離子及萃取柱U3000型液相色譜儀(美國ThermoFisher);PWAX固相萃取柱(天津博納艾杰爾科技):弱陰離子150mg/1ml;液相色譜柱InnovalC1.2標(biāo)準(zhǔn)儲備液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制甲醇色譜純;乙酸鋅溶液(1.0mol/L):稱取22g乙酸鋅,用水溶解并定容至100ml;草酸鉀/磷酸氫二鉀溶液:稱取3.0g草酸鉀和7.0g磷酸氫二鉀,用水溶解并定容至100ml;檸檬酸溶液:稱取20g檸檬酸,用水溶解并定容至100ml;氨水溶液(5%):取5ml氨水用水定容至100ml;pH6水溶液:水加檸檬酸溶液調(diào)pH值至6;氨化甲醇溶液(3%):取3ml氨水加入到97ml甲醇中;乙酸銨溶液(0.02mol/L):稱取1.54g乙酸銨用水溶解并定容至1000ml,過0.45μm濾膜;合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)品:檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)儲備液(0.5mg/ml)、莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)儲備液(0.5mg/ml)、胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)儲備液(0.5mg/ml)、日落黃標(biāo)準(zhǔn)儲備液(0.5mg/ml)、誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0mg/ml)、亮藍標(biāo)準(zhǔn)儲備液(0.5mg/ml)和赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0mg/ml)(購自中國計量科學(xué)研究院),酸性靛藍固體標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.9%,購自Dr.Ehrenstorfer公司);超純水。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:酸性靛藍標(biāo)準(zhǔn)儲備液(0.5mg/ml):準(zhǔn)確稱取適量酸性靛藍固體標(biāo)準(zhǔn)品,用水溶解并定容?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(100μg/ml):分別移取適量合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用水定容?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)系列:準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(100μg/ml),用水配制成0.2μg/ml、0.5μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)系列。1.3樣品處理1.3.1樣品處理和凈化液體飲料、液體調(diào)味料、果汁、配制酒類、蜜餞、糖果、果凍等:稱取2g樣品于15ml聚丙烯刻度離心管中(含二氧化碳的樣品可超聲波超聲15min除去二氧化碳;酒類加熱除去乙醇;固體樣品加20ml水,加熱溶解樣品,蛋白質(zhì)含量高的樣品加1ml乙酸鋅溶液和1ml草酸鉀/磷酸氫二鉀溶液,充分漩渦混勻。)用氨水溶液調(diào)pH至6左右,用水定容至10ml,10000r/min離心5min,上清液待凈化。玉米粉、小米和小米粉等:稱取2g粉碎后樣品于50ml聚丙烯刻度離心管中,加10ml氨化甲醇溶液,漩渦混勻1min,超聲提取15min,4000r/min離心3min,上清液轉(zhuǎn)移至試管中;樣品殘渣用氨化甲醇溶液重復(fù)提取至提取液無色,合并提取液于60℃水浴氮吹近干,用水定容至10ml,10000r/min離心5min,上清液待凈化。番茄醬等調(diào)味品:稱取2g樣品于50ml聚丙烯刻度離心管中,加10ml氨化甲醇溶液,漩渦混勻1min,超聲提取15min,4000r/min離心3min,上清液轉(zhuǎn)移至試管中;樣品殘渣用氨化甲醇溶液重復(fù)提取至提取液無色,合并提取液于60℃水浴氮吹近干,用水定容至10ml,10000r/min離心5min,上清液待凈化。肉制品:稱取2g均質(zhì)后樣品于50ml聚丙烯刻度離心管中,加20ml石油醚,漩渦混勻1min,4000r/min離心3min,棄去石油醚層,殘渣重復(fù)上述過程去脂3次;向樣品殘渣中加10ml氨化甲醇溶液,漩渦混勻1min,4000r/min離心3min,上清液轉(zhuǎn)移至試管中;樣品殘渣用氨化甲醇溶液重復(fù)提取至提取液無色,合并提取液于60℃水浴氮吹近干,用水定容至10ml,10000r/min離心5min,上清液待凈化。1.3.2固相萃取柱的制備預(yù)先用6ml甲醇和6ml水活化PWAX固相萃取柱,取5ml上述樣品提取液,以1ml/min的速度通過預(yù)先活化后的PWAX固相萃取柱;再分別用6mlpH6水溶液和6ml甲醇淋洗固相萃取柱,將固相萃取柱通入空氣吹干;最后用6ml氨化甲醇洗脫并收集,60℃水浴氮氣吹近干,加1ml水復(fù)溶,若溶液渾濁,可10000r/min離心10min,上清液待上機測定。1.4條件1色譜柱C2結(jié)果2.1回收率、精密度、標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.4色譜條件下檢測,檸檬黃、莧菜紅、酸性靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍和赤蘚紅等目標(biāo)化合物分離度R>1.5,分離良好,測定不受干擾。PDA檢測結(jié)果見圖1;使用UV檢測器,通過切換波長,各目標(biāo)化合物均呈現(xiàn)最大吸收峰,見圖2,圖3為樣品加標(biāo)色譜圖。在11.30min、11.63min分離出3個亮藍同分異構(gòu)體色譜峰。見圖4。在飲料(康師傅冰紅茶)、果酒(藍莓酒)、果凍(喜之郎草莓味)和調(diào)味品(番茄沙司)樣品中加入一定量著色劑標(biāo)準(zhǔn)液形成0.4mg/kg、2.0mg/kg、10mg/kg的加標(biāo)濃度,按照1.3對應(yīng)的樣品處理方法提取凈化,進行HPLC分析的結(jié)果。8種合成著色劑在PWAX固相萃取柱回收率為73.0%~102.7%、RSD為0.46%~5.35%。見表3。根據(jù)GB2760食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中合成著色劑的限值要求,配置8種著色劑標(biāo)準(zhǔn)系列0.2μg/ml、0.5μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml、20μg/ml,在上述實驗條件下檢測分析,相關(guān)系數(shù)r為0.99991~0.99999,顯示線性關(guān)系良好。見表2。進樣一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以3倍信噪比的峰面積所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為方法檢出限,以10倍信噪比的峰面積所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為方法定量限。若取樣量2.0g,定容至10ml時,取上清液5.0ml上柱,凈化液定容至1.0ml,8種著色劑檢出限均為0.020mg/kg,對應(yīng)于上機測試液中的濃度為0.020μg/ml;定量限均為0.060mg/kg,對應(yīng)于上機測試液中的濃度為0.060μg/ml。2.4番茄沙司和正常值的單因素見表1選取不同類別的代表樣品,按照上述方法分析,外標(biāo)法定量,果凍中胭脂紅0.95mg/kg;粉腸中誘惑紅4.71mg/kg、赤鮮紅0.029mg/kg;番茄沙司中日落黃0.76mg/kg、誘惑紅0.057mg/kg、赤鮮紅14.57mg/kg;橄欖蜜餞中亮藍10.65mg/kg;裱花蛋糕中亮藍36.12mg/kg、赤鮮紅10.68mg/kg;橘子味飲料中檸檬黃11.43mg/kg、日落黃12.85mg/kg。3討論3.1黃、紫菜紅和酸性理想為利于色譜峰的分離,選用0.02mol/L乙酸銨溶液與甲醇梯度洗脫。5min內(nèi),采用甲醇緩慢上升,使檸檬黃、莧菜紅和酸性靛藍很好分離。檸檬黃、莧菜紅、酸性靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍和赤蘚紅的特征波長分別為428nm、521nm、608nm、509nm、483nm、507nm、625nm和529nm,因此在其出峰時間段設(shè)置相應(yīng)的波長編程模式,以獲得最大吸收峰,靈敏度顯著提高,也使得8種合成著色劑的最大吸收峰呈現(xiàn)在一張圖譜上。3.2著色劑的制備碳酸飲料和配制酒,除去二氧化碳或乙醇后即可上柱凈化,操作簡便。蜜餞、糖果、果凍、果汁等富含大量的氨基氮和蛋白質(zhì)等有機物,基體中的蛋白質(zhì)會把著色劑鍵合或包裹,直接提取回收率極低,使用乙酸鉛-草酸鉀磷酸氫二鉀沉淀蛋白質(zhì)后,再用水提取效果好,并且8種合成著色劑加標(biāo)回收率高,效果滿意。小米、玉米、調(diào)味品、肉制品中的合成著色劑雖溶于水,但直接用水提取回收率低,氨化甲醇能改善其提取效果,獲得滿意回收率。3.3合成著色劑的篩選檸檬黃等大多數(shù)合成著色劑為苯磺酸鈉結(jié)構(gòu),酸性條件下能被聚酰胺粉吸附,而赤蘚紅為苯甲酸鈉結(jié)構(gòu),酸性條件難以被聚酰胺粉吸附,所以包括國標(biāo)GB/T5009.35在內(nèi)的檢測前處理方法只有7種合成著色劑,赤蘚紅采用的是液-液萃取的方法。本方法使用弱陰離子固相萃取柱(PWAX),可以同時測定檸檬黃、莧菜紅、酸性靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍等苯磺酸鈉結(jié)構(gòu)和赤蘚紅等苯甲酸鈉結(jié)構(gòu)的合成著色劑。配合全自動固相萃取儀,大大減少試劑用量,自動化操作,簡單方便,適合大批量樣品檢測,易于推廣。3.4洗脫前吹干小柱弱陰離子固相萃取柱(PWAX)的填料結(jié)構(gòu)表明:當(dāng)溶液pKa大于-NH洗脫前吹干小柱是為了將水分吹干,防止后面氮吹時間過長,且如果有過多水分存在,會稀釋后面的氨化甲醇,使甲醇的濃度降低,洗脫效果會受影響。用氨化甲醇洗脫,氨水和水的存在是為了抑制-NH3.5蒸發(fā)溝通和濾膜過濾國標(biāo)GB/T5009.35方法是將凈化洗脫液水浴蒸發(fā)濃縮,實際操作中合成著色劑附著在蒸發(fā)皿壁上不易復(fù)溶,造成損失。且多種合成著色劑能被再生纖維素等水系濾膜吸附,因此不應(yīng)使用濾膜過濾樣品。本方法將凈化洗脫液于60℃水浴氮氣吹近干,加1ml水復(fù)溶,混勻,若溶液渾濁,可10000r/min離心10min,上清液待上機測定,回收率高。3.6鄰位磺化物的制備亮藍(brilliantblue)為非偶氮類酸性染料,苯磺酸結(jié)構(gòu),主要有3個同分異構(gòu)體,其間位磺化物ue5fe對位磺化物ue5fe鄰位磺化物=75~85ue5fe15~20ue5fe0~8本實驗在國