流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用描述課件

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用何玉萍流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用1科研型分選功能488nm激光四色熒光(525、575、610、675nm）科研型2一、流式細(xì)胞術(shù)的原理

流式細(xì)胞儀的發(fā)展起源于細(xì)胞計(jì)數(shù)自動化的研究。其原理是被熒光染色的單細(xì)胞或顆粒，經(jīng)過高速的液流系統(tǒng)形成細(xì)胞柱，排列成單細(xì)胞依次通過流動室，在激光照射區(qū)域，攜帶熒光素細(xì)胞受激發(fā)產(chǎn)生不同的熒光信號，這些熒光信號可以反映細(xì)胞的生物特性。一、流式細(xì)胞術(shù)的原理流式細(xì)胞儀的發(fā)展起源3前向散射激光前向散射激光4FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個細(xì)胞流）樣本管鞘液管FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個細(xì)胞流）樣本管鞘液管5

近30年來流式細(xì)胞術(shù)在我國得到很快的發(fā)展，應(yīng)用范圍不斷增大。目前，流式細(xì)胞術(shù)作為一門生物檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。

6二、流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)、優(yōu)點(diǎn)速度快

極短時間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，每秒可檢測上萬個細(xì)胞，甚至幾萬個細(xì)胞。多參數(shù)分析

可同時分析單個細(xì)胞的多種特性，獲得單個細(xì)胞多種信息，也可以根據(jù)其細(xì)胞表面標(biāo)志的不同把細(xì)胞群分為各亞群。二、流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)、優(yōu)點(diǎn)速度快7定性、定量分析細(xì)胞

通過熒光染色對單細(xì)胞的某些成分，如：DNA、抗原或受體等進(jìn)行定性、定量分析。

靈敏度高

熒光能檢測到單個微粒上標(biāo)有熒光分子少于<600個(如FITC或PE)；前向角檢測到小于0.3um顆粒。

分選感興趣的細(xì)胞

純度達(dá)99%，收獲率可達(dá)90%。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用描述ppt課件8流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍細(xì)胞大小細(xì)胞表面分子:CD系列細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞核內(nèi)分子：P53細(xì)胞功能檢測:細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡其他：線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍9常用熒光素激發(fā)光波長（nm）

發(fā)射波長(nm)異硫氰酸（FITC）488525（綠）藻紅蛋白（PE）488575（橙）碘化丙啶（PI）488610（紅）藻紅蛋白偶聯(lián)物（PE-CY5）488667（紅）藻紅蛋白偶聯(lián)物（PE-CY7）488767（紅外）別藻青蛋白（APC）633660（紅）別藻青蛋白偶聯(lián)物（APC-CY7）633767（紅外）三、單克隆抗體標(biāo)記熒光探針選擇1.了解激發(fā)光波長和發(fā)射波長常用熒光素激發(fā)光波長（nm）發(fā)射波長(nm)異硫氰酸（F10

2.要有高的光子產(chǎn)量---提高信號強(qiáng)度。3.對激光有強(qiáng)的吸收----降低背景噪音。4.激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間差距大---減少干擾。5.易與被標(biāo)記的物質(zhì)結(jié)合，而不影響被標(biāo)記物的特異性。6.穩(wěn)定性好，不易受光、溫度、標(biāo)本抗凝劑和固定劑等影響。

11常用熒光探針組合細(xì)胞表型分析：

雙色分析：FITC與PE三色分析：雙色分析+PE-CY5四色分析：三色分析+ECDDNA含量分析：PI凋亡與壞死分析：

凋亡用AnnexinV-FITC/PI雙染常用熒光探針組合細(xì)胞表型分析：12四、標(biāo)本的收集、單細(xì)胞懸液的制備

骨髓、外周血、細(xì)胞株、組織器官、胸水、腹水、尿液脫落細(xì)胞等

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用描述ppt課件131、骨髓及外周血細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備

骨髓及外周血都是天然的單個細(xì)胞，可直接標(biāo)記，再溶血。單細(xì)胞的分離制備分離液血液+生理鹽水離心2500r/min，20-30min

單個核細(xì)胞單細(xì)胞的分離制備14單核細(xì)胞:

利用單核細(xì)胞在短時培養(yǎng)貼壁快的特性（30-40min），可采用短時培養(yǎng)獲得較純的單核細(xì)胞.單核細(xì)胞:152、培養(yǎng)細(xì)胞樣品的制備(貼壁細(xì)胞)

培養(yǎng)板吸去培養(yǎng)液PBS洗2次胰蛋白酶

37℃，室溫，3-5min

含血清的培養(yǎng)基吹打PBS洗2次單細(xì)胞懸液。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用描述ppt課件163.組織器官單細(xì)胞懸液的制備

酶消化法

組織器官

單細(xì)胞制備儀

剪碎法

機(jī)械法

網(wǎng)搓法

研磨法

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用描述ppt課件17（1）、酶消化法組織塊洗去血液剪成小塊

胰蛋白酶37℃，15-30min含血清的培養(yǎng)基100目鋼篩網(wǎng)過濾300目尼龍網(wǎng)過濾離心1000r/min，5minPBS洗2次單細(xì)胞懸液。（1）、酶消化法18（2）、機(jī)械法

單細(xì)胞制備儀

組織塊洗去血液剪成小塊

制備儀

2-3min

100目鋼篩網(wǎng)過濾300目尼龍網(wǎng)過濾離心1000r/min，5minPBS洗2次單細(xì)胞懸液。

剪碎法

組織塊洗去血液

剪至漿狀吸管輕輕吹打

100目鋼篩網(wǎng)過濾300目尼龍網(wǎng)過濾離心1000r/min，5minPBS洗2次單細(xì)胞懸液。

（2）、機(jī)械法19

網(wǎng)搓法

組織塊洗去血液

100目鋼篩網(wǎng)輕搓

生理鹽水收集濾液300目尼龍網(wǎng)過濾離心1000r/min，5min

PBS洗2次單細(xì)胞懸液。

研磨法

組織塊洗去血液

研磨器研至勻漿

100目鋼篩網(wǎng)300目尼龍網(wǎng)過濾離心1000r/min，5minPBS洗2次單細(xì)胞懸液。

204.石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液的制備

醇乙脫水：

70％→80%→90％→95%→100%醇乙→二甲苯→石蠟包埋

脫蠟水化：

二甲苯脫蠟→100％醇乙→90%→80%→70％→50％→蒸餾水手術(shù)獲得的新鮮實(shí)體組織，常要送病理石蠟包埋處理，這些標(biāo)本也可用于流式細(xì)胞術(shù)的檢測。4.石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液的制備

醇乙脫水：

70％→821石蠟包埋組織制備

單細(xì)胞懸液

石蠟包埋組織切片二甲苯脫蠟1-2天水化

乙醇，蒸餾水組織器官胰蛋白酶37℃，15-30min

冰PBS100目鋼篩網(wǎng)過濾300目尼龍網(wǎng)過濾離心1000r/min，5minPBS洗2次單細(xì)胞懸液石蠟包埋組織制備

單細(xì)胞懸液225.脫落細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備包括：尿液脫落細(xì)胞胸水、腹水脫落細(xì)胞沖洗液脫落細(xì)胞

5.脫落細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備23收集胸水、腹水、尿液、沖洗液置4℃冰箱中沉淀取底部10-20mlPBS洗3次300目尼龍濾網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液收集方法、沉淀時間胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml肝素液，置于4℃冰箱中靜置6-12h尿液：收集24h尿液，置4℃冰箱中自然沉淀2h沖洗液：300-500ml生理鹽水沖洗膀胱，冰箱內(nèi)置

6-12h收集胸水、腹水、尿液、沖洗液置4℃冰箱中24五、熒光標(biāo)記主要包括間接免疫熒光染色和直接免疫熒光染色兩種方法。

間接標(biāo)記是采用特異的無熒光標(biāo)記的一抗與待測標(biāo)本反應(yīng)后，洗去未結(jié)合抗體再加入熒光標(biāo)記的二抗，形成有熒光的抗原--抗體--抗體復(fù)合物。其操作復(fù)雜、費(fèi)時，目前很少用。在科研中需要一些新的抗體沒有直接抗體，只能采用此方法。

直接標(biāo)記是在標(biāo)記時加入連接著熒光素的特異性抗體，該方法簡單，目前廣泛應(yīng)用于各實(shí)驗(yàn)室。羊抗兔兔抗小鼠小鼠直標(biāo)間標(biāo)五、熒光標(biāo)記羊抗兔直標(biāo)間標(biāo)25

根據(jù)細(xì)胞部位的不同，可分為細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原染色，細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記需要固定、破膜等步驟

1.細(xì)胞表面抗原的標(biāo)記法（外周血為例

）

全血50ul（5×105）+10ul相應(yīng)抗體→避光孵育15-30min→溶血素→室溫10min→PBS洗1次→上機(jī)分析（1%多聚甲醛固定）。

262.細(xì)胞漿或核內(nèi)抗原標(biāo)記法

收集單細(xì)胞懸(1×106)+固定劑A

室溫，15min洗滌去固定液破膜劑B及抗體

室溫，15min

PBS洗滌1次上機(jī)分析（1%多聚甲醛固定）。3.細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原同時標(biāo)記在流式分析中通常需要細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)同時標(biāo)記，首先標(biāo)記表面抗原，然后再對細(xì)胞膜和核膜進(jìn)行固定破膜后再標(biāo)記胞內(nèi)或核內(nèi)抗原。

常見細(xì)胞破膜劑：0.05%皂角素、0.1%曲拉通(TritonX-100)、70%乙醇、商品化固定破膜劑（A、B）。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用描述ppt課件271、空白對照用緩沖液（PBS）代替單克隆抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)2、陽性染色對照用現(xiàn)有試劑和方法檢測已知表達(dá)某種特異性抗原的細(xì)胞即為陽性細(xì)胞。如檢測血小板CD62P時，可用被ADP誘導(dǎo)活化血小板作為CD62P檢測的陽性對照細(xì)胞。六、熒光染色對照設(shè)置(空白對照、陽性對照、陰性對照、

同型對照

)1、空白對照用緩沖液（PBS）代替單克隆抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)六、283.陰性染色對照已知不表達(dá)某種抗原的細(xì)胞即為陰性細(xì)胞群，如CD3/CD19雙染檢測健康人血液淋巴細(xì)胞亞群時，應(yīng)有一群不表達(dá)這兩種抗原的雙陰性細(xì)胞群（主要是NK細(xì)胞），可作陰性對照。4.同型對照與染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型，如IgG-FITC、IgG-PE3.陰性染色對照已知不表達(dá)某種抗原的細(xì)胞即為陰性細(xì)胞群，如C29七、熒光補(bǔ)償

流式細(xì)胞分析中常需要兩種或兩種以上不同熒光素標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行多色分析。由于目前使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射光譜性質(zhì)，發(fā)射光譜范圍有一定的重疊，出現(xiàn)結(jié)果誤差，克服這種誤差的有效方法就是使用熒光補(bǔ)償。七、熒光補(bǔ)償30流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用描述ppt課件31流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用描述ppt課件32八、數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞術(shù)的目的是對我們感興趣的細(xì)胞進(jìn)行分析，其中設(shè)門技術(shù)是流式細(xì)胞數(shù)據(jù)分析中最為獨(dú)特的技術(shù)，是指在細(xì)胞分布圖中指定一個范圍或一片區(qū)域（門），對其中的細(xì)胞進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)分析。設(shè)門包括線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意門和四象門等。任意門、矩形門線性門四象門任意門、矩形門線性門33多重邏輯門：當(dāng)一種細(xì)胞有兩種以上的參數(shù)需要被分析時，常需要設(shè)多個門，各門之間由此出現(xiàn)邏輯關(guān)系，此種設(shè)門技術(shù)稱為多重邏輯門或聯(lián)合門。淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)胞（CD3+）CD3+CD8-IFN-rIL-4（CD4+）多重邏輯門：當(dāng)一種細(xì)胞有兩種以上的參數(shù)需要被淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)34數(shù)據(jù)顯示采用的圖:散點(diǎn)圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為單參數(shù)直方圖和雙參數(shù)散點(diǎn)圖。數(shù)據(jù)顯示采用的圖:散點(diǎn)圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常35參數(shù)的意義:FSC的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，也就是說，細(xì)胞越大，散射光越強(qiáng)，細(xì)胞越小,散射光越弱;SSC對細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可反映細(xì)胞顆粒性程度大小。單參數(shù)直方圖X軸代表熒光或散射光的強(qiáng)度，Y軸代該道所具有相同光信號細(xì)胞的頻率或相對的細(xì)胞數(shù)；雙參數(shù)散點(diǎn)圖X軸和Y軸均代表散射光或熒光的強(qiáng)度.SSCFSC參數(shù)的意義:SSCFSC36

九、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用及標(biāo)記方法

九、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用及標(biāo)記方法

371、DNA含量分析

意義：腫瘤的早期診斷，腫瘤的良惡性判斷，觀察細(xì)胞的增殖狀態(tài)及細(xì)胞周期分布。正常生物細(xì)胞，DNA含量隨著細(xì)胞增殖周期時相而發(fā)生變化。即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C）G2/M期（4C）。2C2C→4C4C2C2C→4C4C38

FCM進(jìn)行細(xì)胞周期DNA含量分析時，需要對DNA進(jìn)行染色，DNA染料（PI）與DNA結(jié)合具有特異性，有一定量效關(guān)系，即DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度與DNA吸收熒光分子多少成正比。FCM分析一個細(xì)胞群周期與DNA倍體時，將DNA含量直方圖分為三部分，即G0/G1、S、G2/M三個細(xì)胞峰。G2/M(4C)G0/G1(2C)

S(2C→4C)G2/M(4C)FCM進(jìn)行細(xì)胞周期DNA含量分析時，需要對DNA進(jìn)行39方法：細(xì)胞懸液（1*106）70%冰乙醇4oC

，24h離心去固定液PBS洗2次RNase30minPBS洗1次PI避光,30min

上機(jī)采集10000細(xì)胞，MultiCycle軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析G0/G1(2C)

S(2C→4C)G2/M(4C)方法：G0/G1SG2/M40當(dāng)人體癌變或者具有惡性潛能的癌前病變時，在其發(fā)生、發(fā)展過程中可伴隨有細(xì)胞DNA倍體及S期的改變（異倍體）惡性腫瘤細(xì)胞增殖周期的判斷：S>10、G2/M>15或S>20、G2/M>5當(dāng)人體癌變或者具有惡性潛能的癌前病變時，在其發(fā)生、412、淋巴細(xì)胞亞群分析

白細(xì)胞分化抗原（CD分子）的命名：1982年世界衛(wèi)生組織和國際免疫學(xué)會聯(lián)合會，將所有抗體根據(jù)白細(xì)胞分化抗原反應(yīng)性的類型劃分為25群，把每一群抗體稱為一個分化抗體群(ClusterofDifferentiation，CD)，進(jìn)行編號、命名，即為單克隆抗體的國際命名法。由CD抗體群識別的分化抗原就稱為CD分子。目前已有339個分化抗體群被鑒定并命名2、淋巴細(xì)胞亞群分析白細(xì)胞分化抗原（CD分子）的命名：42

流式細(xì)胞結(jié)合單克隆抗體技術(shù)能準(zhǔn)確分類計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞亞群，被認(rèn)為是血液中淋巴細(xì)胞免疫表型分析的標(biāo)準(zhǔn)方法。血液淋巴細(xì)胞是一群特異性極強(qiáng)的細(xì)胞，根據(jù)淋巴細(xì)胞的功能及膜表面標(biāo)志，主要分為T淋巴細(xì)胞(CD3+)、B淋巴細(xì)胞(CD19+)、NK細(xì)胞(CD16+56+/CD3-)三個亞群。流式細(xì)胞結(jié)合單克隆抗體技術(shù)能準(zhǔn)確分類計(jì)數(shù)淋巴43CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞（CD3+）淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞（CD19+）NK細(xì)胞（CD16+56）+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+44NK細(xì)胞:CD(16+56)+/CD3-B淋巴細(xì)胞:CD19+/CD3-NK+/CD3-CD（16+56）+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3-NK細(xì)胞:B淋巴細(xì)胞:NK+/CD3-CD（16+56）+/45外周血淋巴細(xì)胞亞群標(biāo)記方法（表面標(biāo)記）

50ul+10ul相應(yīng)抗體避光孵育15min加OptiLyesC溶血素250ul室溫10minPBS洗一次上機(jī)分析抗體:

CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三標(biāo)抗體CD19-PE/CD3-FITC二標(biāo)抗體CD16+56-PE/CD3-FITC二標(biāo)抗體IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型對照外周血淋巴細(xì)胞亞群標(biāo)記方法（表面標(biāo)記）50u46淋巴細(xì)胞亞群檢測臨床意義：CD3+、CD4+、CD8+總數(shù)降低：細(xì)胞免疫功能低下CD4+（CD4+/CD8+）降低或CD8+(CD8+/CD4+)升高：AIDS、病毒感染、惡性腫瘤（復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移）、再生障礙性貧血等CD4+(CD4+/CD8+)升高或CD8+(CD8+/CD4+)降低：自身免疫性疾、多發(fā)性硬化病、自身免疫性溶血性貧血CD3+CD4+CD8+T細(xì)胞減少：見于免疫球蛋白缺乏癥、胸腺發(fā)育不良、嚴(yán)重免疫缺陷病。淋巴細(xì)胞亞群檢測臨床意義：47NK[CD(16+56)+]活性低下：腫瘤、白血病、自身免疫病、免疫缺陷病等NK+[CD(16+56)+]活性增高：多發(fā)性骨髓瘤、骨髓移植感染、感染性疾?。˙病毒、皰疹病毒、肺TB）、習(xí)慣性流產(chǎn)等CD19+B細(xì)胞減少：體液免疫抑制CD19+B細(xì)胞增高：B細(xì)胞惡性增殖性疾?。ò籽。┝魇郊?xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用描述ppt課件483、白血病免疫分型

FCM作為白血病輔助診斷，免疫分型是急白血病診斷的關(guān)鍵技術(shù)。利用不同類型的白血病具有不同抗原表達(dá)的特異性進(jìn)行分型：髓系、B淋巴系、T淋巴系、非系列特異性等。標(biāo)記方法：往往需要胞漿和胞膜同時標(biāo)記，一線抗體包括：胞漿（髓系-MPO，B淋巴系-CD79a,T淋巴系-cyCD3）,胞膜(髓系-CD13、CD117，B淋巴系-CD19、CD10,T淋巴系-CD3、CD2)等3、白血病免疫分型FCM49

采用CD45和側(cè)向散射(SSC）設(shè)門技術(shù)可將各細(xì)胞群分開，熒光從強(qiáng)大到弱：淋巴細(xì)胞群>單核細(xì)胞>成熟粒細(xì)胞>原/幼細(xì)胞(白血病細(xì)胞)，而成熟的紅細(xì)胞和血小板不表達(dá)。采用CD45和側(cè)向散射(SSC）設(shè)門技術(shù)可將各細(xì)胞群分開，50正常骨髓流式細(xì)胞分布圖正常骨髓流式細(xì)胞分布圖51各系表達(dá)的抗原造血干細(xì)胞：CD34、CD33髓系表達(dá)：CD13、CD14、CD33巨核細(xì)胞：CD61、CD41B細(xì)胞系：CD10、CD19、CD20T細(xì)胞系：CD2、CD3、CD5、CD7NK細(xì)胞:CD16、CD56、CD57各系表達(dá)的抗原524、細(xì)胞因子的檢測細(xì)胞因子（CK）主要由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，也可由非免疫細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生。一種細(xì)胞可產(chǎn)生多種CK，一種CK也可由多種細(xì)胞產(chǎn)生。細(xì)胞因子分為4類：白細(xì)胞介素（lL）；干擾素（IFN）；造血生長因子；腫瘤壞死因子（TNF）。4、細(xì)胞因子的檢測細(xì)胞因子（CK）主要由免疫細(xì)胞產(chǎn)53

血液中未活化的白細(xì)胞內(nèi)無或僅極小量細(xì)胞因子，當(dāng)其被各種激活劑活化后，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子合成增加并不斷分泌到細(xì)胞外而發(fā)揮作用。因此，要測定細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子較為困難。通常應(yīng)用刺激劑（如：佛波脂）來刺激細(xì)胞因子分泌，同時加入一定濃度的細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑（如：莫能霉素），使細(xì)胞因子合成后累積在細(xì)胞內(nèi)，通過細(xì)胞因子特異的單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)熒光染色，并結(jié)合膜表面抗原染色，進(jìn)行多色分析各種細(xì)胞內(nèi)合成的細(xì)胞因子。血液中未活化的白細(xì)胞內(nèi)無或僅極小量細(xì)胞因子，當(dāng)其被各種54流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用描述ppt課件55細(xì)胞因子檢測（IFN-r，IL-4）：全血或單細(xì)胞+刺激素(佛波脂)和阻斷劑(莫能霉素)37℃培養(yǎng)4-6h加入細(xì)胞表面抗體(如CD3、CD4/CD8)孵育20-30minPBS洗1次加固定破膜劑室溫15min加入IFN-r和IL-4抗體孵育30minPBS洗兩次FCM。細(xì)胞因子檢測（IFN-r，IL-4）：全血或單細(xì)胞+刺激素56結(jié)果分析：運(yùn)用流式設(shè)門技術(shù)，先利用前向散射（FS）和側(cè)向散射（SS）圈出淋巴細(xì)胞，再用CD3+和SSC設(shè)門圈出T淋巴細(xì)胞，再用CD8-/CD3+設(shè)門選定T淋巴細(xì)胞亞群，再分析IL-4+和CD4+/IFN-r淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)胞（CD3+）CD3+CD8-（CD4+）IFN-rIL-4結(jié)果分析：運(yùn)用流式設(shè)門技術(shù)，先利用前向散射（FS）和側(cè)向散射575、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

Ca2+超載是細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志，導(dǎo)致DNA降解，促使細(xì)胞凋亡。

檢測Fluo-3/Am是高特異性Ca2+熒光指示劑，能與Ca2+特異結(jié)合。Fluo-3它本身是親水性，不易透過膜的，依賴其脂溶性AM（乙酰氧甲基），酯化后就容易跨過質(zhì)膜進(jìn)入胞漿，在胞內(nèi)酯酶的作用下，脫去AM重新生成親水性形式，一方面不能再進(jìn)入細(xì)胞器，另一方面易于在胞內(nèi)擴(kuò)散，與游離鈣離子結(jié)合，通過檢測其熒光強(qiáng)度可反映出細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化。單細(xì)胞懸液+flour-3/AM37oC避光孵育40minPBS洗1次上機(jī)檢測

5、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

Ca2+超載是細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志，導(dǎo)586、線粒體膜電位

線粒體膜電位（MMP）是線粒體功能的重要參數(shù)，是評價線粒體功能的敏感指標(biāo)，它的大小直接反映線粒體功能及數(shù)量，MMP下降，其氧化磷酸化功能障礙，使ATP產(chǎn)生減少，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。6、線粒體膜電位線粒體膜電位（MMP）是線粒體59MMP檢測原理及方法：

Rhodamine123（羅丹明123）、DiOC6、JC-1等多種親脂性的陽離子熒光素都能被流式細(xì)胞分析用于作為檢測MMP的探針。這些親脂性熒光染料，對膜具有通透性，另外線粒體內(nèi)外膜之間存在著跨膜電位，線粒體內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)帶負(fù)電荷，當(dāng)它們與活細(xì)胞一起培養(yǎng)時，這些陽離子熒光素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)就能特異地聚集于線粒體，其攝入量與線粒體膜電位成正比。

MMP檢測原理及方法：Rhodamine123（羅丹明160當(dāng)MMP降低后，線粒體內(nèi)的熒光素會發(fā)生外漏，在細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低。檢測其熒光強(qiáng)度能反映線粒體數(shù)量和MMP的降低或喪失。操作：單細(xì)胞懸液（1*106

）+1umol/L的Rh12337oC,30minPBS洗兩次上機(jī)檢測當(dāng)MMP降低后，線粒體內(nèi)的熒光素會發(fā)生外漏，在細(xì)胞內(nèi)熒光617、FCM檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序結(jié)束其生命的過程。細(xì)胞凋亡為一種可調(diào)控的、主動的細(xì)胞死亡過程，有很多的促進(jìn)或抑制凋亡的調(diào)控途徑存在，因而就可以人為地誘導(dǎo)或抑制某些細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到防病、治病的目的。7、FCM檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡是細(xì)62（1）Caspase家族

半胱氨酸蛋白酶（Caspase）以無活性的酶原形式存在細(xì)胞內(nèi)，需被水解加工后才能成為有活性的片段。活化的Caspase進(jìn)一步激活其他的Caspase前體，形成了級聯(lián)放大切割過程，是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，目前已發(fā)現(xiàn)15個Caspase家族成員，分別命名為Caspase1-15。在Caspase家族成員中，Caspase-3是最重要的指示蛋白酶。

（1）Caspase家族半胱氨酸蛋白酶（Caspa63操作：單細(xì)胞懸液（1*106）固定和破膜劑冰浴20minPerm/WashBuffer洗兩次20ul單抗室溫孵育30minPerm/WashBuffer洗1次加0.5mlPerm/WashBuffer上機(jī)檢測。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用描述ppt課件64（2）凋亡相關(guān)基因蛋白

細(xì)胞凋亡過程中有多種基因蛋白參與調(diào)控。凋亡相關(guān)基因可分兩類：誘導(dǎo)凋亡基因和抗凋亡基因。主要有bcl-2家族、P53、ced基因家族等。抗凋亡基因:bcl-2、bcl-XL、Bad等促凋亡基因:bax、bak、bcl-XS等染色標(biāo)記同Caspase（2）凋亡相關(guān)基因蛋白細(xì)胞凋亡過程中有多種基因蛋白參65（3）Fas/Fa