腦科學(xué)研究的方法

多學(xué)科綜合神經(jīng)科學(xué)神經(jīng)解剖學(xué)神經(jīng)生理學(xué)神經(jīng)生物化學(xué)心理學(xué)………..第一章腦科學(xué)研究辦法和伎倆第1頁多層次研究認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)計(jì)算神經(jīng)科學(xué)臨床神經(jīng)科學(xué)系統(tǒng)和行為神經(jīng)科學(xué)發(fā)生神經(jīng)科學(xué)細(xì)胞神經(jīng)科學(xué)分子神經(jīng)科學(xué)神經(jīng)科學(xué)第2頁研究水平整體行為水平：行為學(xué)，軀體感覺，視聽覺，痛覺等

細(xì)胞水平：神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、生物電活動(dòng)檢測(cè)、通路示蹤、細(xì)胞染色、免疫化學(xué)、凋亡檢測(cè)分子水平試驗(yàn)：離子通道、受體、酶、遺傳物質(zhì)等第3頁一、形態(tài)學(xué)辦法二、生理學(xué)辦法三、電生理學(xué)辦法四、生物化學(xué)辦法五、分子生物學(xué)辦法六、腦成像（Brainimaging）技術(shù)第4頁一、形態(tài)學(xué)辦法常規(guī)染色和特殊染色束（通）路追蹤法

熒光組織化學(xué)法原位雜交法受體定位法神經(jīng)系功能活動(dòng)形態(tài)定位法

第5頁1.常用一般染色辦法TTC染色HE鋨酸染色氯化金浸染Cajal銀浸染色尼氏染色第6頁HE（蘇木素－伊紅）第7頁鋨酸染色是神經(jīng)科學(xué)研究一種常用而普遍辦法，它本來是用來固定脂質(zhì)，由于髓鞘主要成份是脂質(zhì)，因此用于有髓神經(jīng)纖維染色

鋨酸染色第8頁氯化金浸染運(yùn)動(dòng)終板Ach熒光染色氯化金浸染第9頁Cajal銀浸染色第10頁尼氏染色多種辦法，HE、甲苯胺藍(lán)，焦油紫，硫堇，天青，派洛寧，中性紅以及棓花青等堿性苯胺染料均能夠使尼氏體著色第11頁2、束（通）路追蹤法：研究神經(jīng)元之間聯(lián)系

第12頁束路追蹤原理：軸漿運(yùn)輸示蹤物質(zhì)：HRP，熒光染料，多種標(biāo)識(shí)物標(biāo)識(shí)葡萄糖，放射性核素標(biāo)識(shí)氨基酸等。觀測(cè)：根據(jù)示蹤物質(zhì)不一樣，采取組織顯色、熒光顯微鏡或放射自顯影等辦法。第13頁軸漿運(yùn)輸法—利用神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸現(xiàn)象追蹤法.

追蹤劑：辣根過氧化物酶(horseradishperoxoidase,HRP)、熒光染料包括核黃(nuclearyellow)、固藍(lán)(fastblue)及熒光金(fluorogold)、植物凝集素如麥芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)和菜豆凝集素(phaseolusvulgarisagglutinin)、細(xì)菌毒素如霍亂毒素、病毒如活神經(jīng)病毒

(胞疹病毒和彈狀病毒）

第14頁l

變性法：利用神經(jīng)元包體受損或神經(jīng)軸突離斷后遠(yuǎn)側(cè)軸突變性，或軸突切斷后細(xì)胞反應(yīng)，來研究纖維聯(lián)系。*物理性辦法：刀切割、電凝、電離破壞、超聲破壞等。*化學(xué)性破壞：興奮性氨基酸（海人酸和鵝高蕈氨酸）、單胺類神經(jīng)毒（６－羥多巴胺、６－羥多巴、雙羥色胺）

第15頁神經(jīng)元質(zhì)膜熒光染料法：

用羰花青（carbocynine）熒光染料，能夠染出神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜，并能夠在活體或固定標(biāo)本上追蹤纖維聯(lián)系。

第16頁最新研究進(jìn)展：

華人學(xué)者繪制小鼠大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖不一樣大腦區(qū)域必須互相溝通才能控制復(fù)雜思想和行為，但目前對(duì)于這些區(qū)域組織成為廣闊神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)機(jī)制卻相對(duì)知之甚少。2023年2月27日《細(xì)胞》（Cell）雜志上一項(xiàng)新研究中，南加州大學(xué)董宏偉等研究人員采取神經(jīng)元示蹤技術(shù)繪制出了一張小鼠全腦圖譜，揭示了大腦皮質(zhì)中數(shù)百條神經(jīng)元通路。在顯微鏡下將可見熒光分子注入到整個(gè)小鼠大腦皮質(zhì)不一樣區(qū)域，這些小分子沿著“細(xì)胞高速馬路”運(yùn)輸，標(biāo)識(shí)了大約600個(gè)神經(jīng)元通路。研究人員采取高辨別率顯微鏡掃描了這些大腦區(qū)域，構(gòu)建出了皮質(zhì)連接圖像數(shù)據(jù)庫。第17頁當(dāng)研究人員分析這些連接時(shí)，他們發(fā)覺大腦皮質(zhì)是一種高度組織化網(wǎng)絡(luò)，由八個(gè)子網(wǎng)絡(luò)組成，它們協(xié)調(diào)活動(dòng)反應(yīng)動(dòng)物情感和感覺。并且，子網(wǎng)絡(luò)之間以一種非常特殊方式來共享這一信息?！斑@些研究發(fā)覺挑戰(zhàn)了流行假說：大腦皮質(zhì)是一種單一網(wǎng)絡(luò)，在這一網(wǎng)絡(luò)中所有一切都密集連接在一起?！苯酉聛?，研究人員可將來自這一主要哺乳動(dòng)物模型系統(tǒng)解剖數(shù)據(jù)與大量現(xiàn)有分子遺傳數(shù)據(jù)合并來鑒別神經(jīng)細(xì)胞基本類型?！按_定全腦構(gòu)造組織將是朝著揭示腦功能以及在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中功能障礙構(gòu)造基礎(chǔ)邁出基本且令人興奮一步，”董宏偉說。第18頁我們真會(huì)永遠(yuǎn)不老嗎？——從“科學(xué)狂人”抗衰老研究說起JohnCraigVenter身上從不缺乏話題。從單槍匹馬與人類基因組計(jì)劃展開競(jìng)爭(zhēng)、時(shí)代雜志將他與人類基因組計(jì)劃代表FrancisCollins同步選為封面人物，到宣布制造出首個(gè)能夠自我復(fù)制活細(xì)胞“Synthia”，轟動(dòng)了整個(gè)學(xué)術(shù)界，Venter每一種舉動(dòng)，在學(xué)術(shù)界都會(huì)引發(fā)波瀾。前陣子，他又宣稱將組建新公司HLI，組建史上最大基因組數(shù)據(jù)庫，結(jié)合基因組學(xué)、生物信息學(xué)及干細(xì)胞療法，致力于抗衰老研究，并延長人類壽命。第19頁【為何我們會(huì)追求不老和長壽】對(duì)于不老和長壽摸索，恐怕是除了“我們是誰”“我們從哪兒來”之外，人們思考第三個(gè)問題了——“我們能否始終存在下去”?！緦?duì)衰老和長壽基因研究】有一種規(guī)律，很多問題，假如解釋不了，就說它是由于基因決定，多半錯(cuò)不到哪里去。也因此，生物學(xué)家、醫(yī)學(xué)家們紛紛開始將遺傳學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合，從基因角度開始對(duì)長壽和衰老問題摸索。第20頁目前基因方面研究主要有兩個(gè)方向，長壽基因和衰老基因。這里說并不是單一基因，而是與長壽和衰老有關(guān)多種基因，它們之間互相作用帶來了不老和長壽成果。衰老體現(xiàn)為染色體端粒長度變化、DNA損傷、甲基化等，衰老終點(diǎn)就是死亡，這些原因也是影響長壽原因。有科學(xué)家以為，端粒（細(xì)胞核兩端特殊DNA片段）長度決定生物壽命，端?？s短會(huì)造成細(xì)胞分裂停頓和死亡來臨。發(fā)覺端粒三位科學(xué)家取得了2023年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。目前“長壽基因”和“衰老基因”還不能完全確定，但有學(xué)者以為，消除自由基某些酶類基因、與細(xì)胞生長調(diào)控有關(guān)某些基因與長壽和衰老有關(guān)。對(duì)于長壽和衰老基因，科學(xué)上還需要繼續(xù)發(fā)覺更多有關(guān)基因，理清那些造成衰老、影響長壽基因群及其之間聯(lián)系，才能在理解基因組基礎(chǔ)上，處理衰老、長壽問題。第21頁【其他長壽和抗衰老措施】除了基因研究外，尚有抗衰老制劑研究。褪黑素與微量元素是被以為有抗衰老作用物質(zhì)。褪黑素自由基清除能力在眾多自由基清除劑中體現(xiàn)尤其突出，而微量元素?cái)z入不協(xié)調(diào)，將造成衰老。尚有一種說法，節(jié)食能夠延長壽命。這背后生物學(xué)原理是：生長激素和胰島素信號(hào)途徑在起作用。科學(xué)家通過對(duì)猴子、酵母菌、果蠅等動(dòng)物研究中驗(yàn)證了減少卡路里攝入能夠延長壽命理論。另某些科學(xué)家提出引發(fā)機(jī)體衰老和疾病是自由基增多，這也是現(xiàn)實(shí)生活中那些宣稱“清除自由基，恢復(fù)年輕態(tài)”保健品所依賴?yán)碚摶A(chǔ)。這些保健品療效有限，請(qǐng)不要容易嘗試。除了遺傳原因之外，人生活環(huán)境、人心理情況等多方面原因都會(huì)影響到壽命。保持愉悅心情，健康生活方式，良好飲食習(xí)慣，這樣雖然軀體不可避免老化，但還是有年輕心態(tài)，總好過長壽但不快樂，年輕外表下，卻住著一種老靈魂。第22頁對(duì)于長壽基因及衰老基因發(fā)掘，也有不贊同聲音。他們以為這違反了倫理道德，假使我們不老不死，那么進(jìn)化要領(lǐng)“生存和繁殖”，也會(huì)越來越少被考慮，我們將剝奪后裔生存機(jī)會(huì)。技術(shù)進(jìn)步帶來潛在社會(huì)問題，尚有待深入去處理。就目前研究情況來看，長壽不意味著不會(huì)永生，科學(xué)幫助下，人們有機(jī)會(huì)將有限生命拉長，將有限生命過得更有質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)不老不病愿望。此時(shí)又想到了Venter先生，據(jù)悉，Venter曾作為美國海軍醫(yī)療隊(duì)醫(yī)院參與越戰(zhàn)，戰(zhàn)場(chǎng)殘酷使他結(jié)識(shí)到生命和時(shí)間珍貴，他以為人生每一分鐘都應(yīng)當(dāng)有所創(chuàng)新。撇開進(jìn)化需要不談，試想有一天，我們不再會(huì)變老，沒有疾病，壽命很長，我們是否還會(huì)像出生即知將死時(shí)候那樣，愛惜生命中每一天，而努力奮斗呢。第23頁3、熒光組織化學(xué)法

用特異性抗體顯示神經(jīng)組織化學(xué)成份辦法。第24頁基本過程有：固定、制片、反應(yīng)等三步。

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免疫組織化學(xué)反應(yīng)：有直接法和間接法

l雙重免疫組織化學(xué)染色：主要是為了研究兩種物質(zhì)在同一細(xì)胞或突起內(nèi)共存現(xiàn)象，或含兩種不一樣化學(xué)物質(zhì)互相關(guān)系。第25頁免疫組化根據(jù)二抗標(biāo)識(shí)不一樣（熒光素、酶、鐵蛋白、膠體金或銀標(biāo)識(shí)），免疫組化包括免疫熒光、免疫酶組織化學(xué)、免疫金銀及鐵標(biāo)識(shí)技術(shù)第26頁核酸分子雜交技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA和DNA序列片段，原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)基因體現(xiàn)?；驹硎歉鶕?jù)兩條單鏈核苷酸互補(bǔ)堿基序列專一配正確特點(diǎn)，應(yīng)用已知堿基序列并具有標(biāo)識(shí)物RNA或DNA片段即核酸探針（probe），與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸（RNA或DNA片段）進(jìn)行雜交，通過標(biāo)識(shí)物顯示，在光鏡或電鏡下觀測(cè)目標(biāo)mRNA或DNA存在與定位。4、原位雜交法

第27頁此項(xiàng)技術(shù)需首先制備某種核酸探針，其種類主要有三種：①利用大肝桿菌重組帶有目標(biāo)基因質(zhì)粒DNA，制成互補(bǔ)DNA探針(cDNA)；②應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶消化制成線性DNA模板，在體外轉(zhuǎn)錄取得反義RNA探針(cDNA)；③根據(jù)待測(cè)核酸核苷酸序列，應(yīng)用DNA合成儀合成寡聚核苷酸探針。cRNA和cDNA常用標(biāo)識(shí)物有32S、32P、3H等放射性核素和熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)。第28頁組織學(xué)應(yīng)用原位雜交術(shù)主要是染色體原位雜交和細(xì)胞原位雜交。前者是研究遺傳基因、抗原基因、受體基因、癌基因等在染色體上定位與體現(xiàn)；后者是研究細(xì)胞某種蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄物mRNA在胞質(zhì)內(nèi)定位與體現(xiàn)。核酸分子雜交術(shù)有很高敏感性和特異性，它是免疫細(xì)胞化學(xué)基礎(chǔ)上，深入從分子水平探討細(xì)胞功能體現(xiàn)及其調(diào)整機(jī)制，已成為目前神經(jīng)生物學(xué)研究主要伎倆。第29頁5、受體定位法：研究受體在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)定位

配體法：主要在組織切片上進(jìn)行，利用標(biāo)識(shí)配體和受體結(jié)合以示蹤其部位

免疫組織化學(xué)法：用針對(duì)受體抗體第30頁6、神經(jīng)系功能活動(dòng)形態(tài)定位法

脫氧葡萄糖法：原理是：神經(jīng)元活動(dòng)時(shí)其能量代謝增加，而其能量代謝主要依賴葡萄糖。在腦內(nèi)存在脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2DG)時(shí)，神經(jīng)元可不加區(qū)分地將2DG與葡萄糖一起攝入細(xì)胞內(nèi)，二者都是己糖激酶底物。但2DG在其被磷酸化成2DG-6-PO4后，不能被磷酸己糖異構(gòu)酶深入轉(zhuǎn)化為果糖-6-PO4，不能繼續(xù)在糖酵解循環(huán)中代謝。如在2DG上標(biāo)以同位素。神經(jīng)元內(nèi)同位素堆積程度反應(yīng)了神經(jīng)元活動(dòng)程度。

第31頁c-fos(Fos)法：

c-fos是一種原癌基因，屬于即刻－早期基因類(immediate-earlygene).很多刺激條件可通過第二信使引發(fā)神經(jīng)元c-fos體現(xiàn)增加，形成fosmRNA。由fosmRNA翻譯成Fos蛋白，立即轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，與另一即刻早基因c-jun所產(chǎn)生蛋白Jun組成二聚體（第三信使），調(diào)整其靶基因體現(xiàn)，引發(fā)一系列細(xì)胞反應(yīng)。

第32頁細(xì)胞色素氧化酶法：

神經(jīng)元線粒體內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶是提供神經(jīng)元能量主要酶，細(xì)胞色素氧化酶水平與神經(jīng)元能量需求密切有關(guān)，一般反應(yīng)慢性刺激成果。

第33頁二、生理學(xué)辦法

損毀法

刺激法周身給藥法腦室注射法腦組織培養(yǎng)亞細(xì)胞分析神經(jīng)遞質(zhì)釋放量測(cè)定

神經(jīng)遞質(zhì)功能測(cè)定

行為學(xué)辦法

最常用有兩種：神經(jīng)行為學(xué)、電生理學(xué)第34頁1、神經(jīng)遞質(zhì)釋放量測(cè)定（在體invivo和離體invitro)推挽灌流法：

在體研究中樞核團(tuán)遞質(zhì)釋放有用辦法。通過推挽灌流套管，使灌流液直接灌流腦組織，從流出液中分析神經(jīng)遞質(zhì)變化。

第35頁第36頁腦透析術(shù)(braindialysis)：在特定腦區(qū)內(nèi)，植入透析探頭，用生理溶液灌流時(shí)，細(xì)胞外液中神經(jīng)遞質(zhì)可順濃度遞度從透析管擴(kuò)散至灌流液中，搜集和測(cè)定灌流液中神經(jīng)遞質(zhì)含量，就能監(jiān)測(cè)該遞質(zhì)變化過程。腦透析術(shù)裝置包括探頭、導(dǎo)管、微量灌流泵、樣品搜集器和定量分析儀。

第37頁第38頁第39頁

抗體微探針法：是在玻璃微電極上涂上一層神經(jīng)肽抗體，用于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)定位神經(jīng)肽釋放。硼硅玻璃與r－氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri-etriethoxysilane）反應(yīng)后在玻璃表面形成一層帶有游離氨基硅氧烷(siloxane)多聚體微粒。該玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)處理，使戊二醛與蛋白質(zhì)A以共價(jià)鍵方式偶聯(lián)，蛋白質(zhì)A再與神經(jīng)肽抗體結(jié)合，制成抗體微探針第40頁腦片灌流法

突觸體灌流法第41頁2、神經(jīng)遞質(zhì)功能測(cè)定

微電泳：能將微量神經(jīng)遞質(zhì)導(dǎo)入神經(jīng)元附近，觀測(cè)其作用?？贵w微量注射：特異性抗體注射在某些部位，可中和神經(jīng)末梢釋放出而進(jìn)入突觸間隙神經(jīng)肽，避免其與受體結(jié)合。因此，抗體微量注射所引發(fā)功能變化可解釋為消除該神經(jīng)肽生理效應(yīng)成果。生物檢測(cè)（Bioassay）:典型辦法.如用水蛭背最長肌測(cè)定ACh作用，敏捷度達(dá)10-10g.第42頁3、行為學(xué)辦法

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典型條件反射：代表了刺激與強(qiáng)化關(guān)系。l操作式條件反射：是通過動(dòng)物本身某個(gè)特定操作動(dòng)作而取得食物或回避有害刺激反應(yīng)活動(dòng)。

第43頁Behavioralneuroscienceisthestudyoftheneuralmechanismsmediatingnormalandabnormalbehaviors.自主活動(dòng)動(dòng)物焦慮檢測(cè)：實(shí)行焦慮原因，如飲食或飲水剝奪，檢測(cè)反應(yīng)，能夠用于藥品篩選。性和生殖行為：進(jìn)化，神經(jīng)內(nèi)分泌作用機(jī)制學(xué)習(xí)記憶攝食行為驚慌反射社會(huì)行為

……..第44頁自主活動(dòng)箱試驗(yàn)動(dòng)物自主活動(dòng)標(biāo)志著動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮狀態(tài)，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮時(shí)，自主活動(dòng)加強(qiáng)，抑制時(shí)則自主活動(dòng)減少。觀測(cè)動(dòng)物自主活動(dòng)是評(píng)價(jià)中樞神經(jīng)興奮狀態(tài)一項(xiàng)主要指標(biāo)。多種作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥品都可影響動(dòng)物自主活動(dòng)，因而自主活動(dòng)統(tǒng)計(jì)是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥品主要辦法，并且在新藥研究中，觀測(cè)藥品對(duì)動(dòng)物自主活動(dòng)影響也是評(píng)價(jià)藥品是否影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要辦法．第45頁自主活動(dòng)箱試驗(yàn)主要技術(shù)指標(biāo)：運(yùn)動(dòng)次數(shù)第46頁洞板試驗(yàn)檢測(cè)小鼠自動(dòng)活動(dòng)，可用于新藥，一般藥理，神經(jīng)系統(tǒng)研究和中樞興奮性，抑制性研究。主要技術(shù)指標(biāo)：小鼠探洞次數(shù)。第47頁學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)檢測(cè)

學(xué)習(xí)記憶功能包括空間學(xué)習(xí)記憶功能和非空間學(xué)習(xí)記憶功能。伴隨對(duì)大腦學(xué)習(xí)記憶機(jī)制研究不停深入以及尋找有效防治認(rèn)知障礙類疾病辦法需要，使得動(dòng)物行為學(xué)試驗(yàn)成為研究腦高級(jí)功能及其他神經(jīng)科學(xué)不可缺乏主要伎倆，客觀精確地評(píng)價(jià)試驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶水平已成為神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)中非常主要研究內(nèi)容。第48頁學(xué)習(xí)記憶功能檢測(cè)常用試驗(yàn)程序空間學(xué)習(xí)記憶任務(wù)非空間學(xué)習(xí)記憶任務(wù)Morris水迷宮T迷宮6或8臂放射狀水迷宮LashleyⅢ

迷宮放射狀迷宮（8臂、12臂）H-W迷宮Y迷宮新奇物體認(rèn)知環(huán)形平臺(tái)嗅覺辨別T迷宮穿梭箱試驗(yàn)跳臺(tái)試驗(yàn)第49頁Morris迷宮1981年，英國心理學(xué)家Morris初次設(shè)計(jì)應(yīng)用了這種水迷宮及其程序。目標(biāo)是幫助大腦學(xué)習(xí)記憶機(jī)制研究。起初試驗(yàn)動(dòng)物主要為大鼠，此后該迷宮系統(tǒng)成為評(píng)定嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶能力典型程序，廣泛利用于神經(jīng)生物學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中。第50頁Morris水迷宮應(yīng)用:判斷動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力組成:觀測(cè)指標(biāo):潛伏期，途徑，不一樣象限停留時(shí)間和長度，搜索策略等第51頁Morris水迷宮第52頁第53頁Morris水迷宮原理水是嚙齒類動(dòng)物非常厭惡刺激或環(huán)境。鼠在水池中就會(huì)急于尋找逃路。它們習(xí)性為在水池四周尋找出口逃避，但深而光滑垂直池壁妨礙了這種企圖。試驗(yàn)中設(shè)置水下平臺(tái)（用于小鼠常為水面下1cm）可提供鼠棲身場(chǎng)所。但在巨大水面上，強(qiáng)迫游泳動(dòng)物不能看見平臺(tái)。它們?nèi)粢杆僬业狡脚_(tái)而避免淹沒就必須利用環(huán)境中線索進(jìn)行定位。從而檢測(cè)了鼠記住環(huán)境中線索及其與平臺(tái)位置關(guān)系而對(duì)平臺(tái)進(jìn)行定位能力（學(xué)習(xí)記憶能力）。第54頁Morris水迷宮長處由于對(duì)年紀(jì)有關(guān)性空間記憶損害有可靠敏感性，Morris水迷宮是判斷老年小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力尤其有用工具。驅(qū)動(dòng)動(dòng)物逃避是水刺激，而不需要食物和水剝奪。因此，避免了剝奪食物和水后給試驗(yàn)動(dòng)物帶來新陳代謝方面問題。動(dòng)物無須接收電休克，這在那些食欲促進(jìn)任務(wù)（appetitivetasks）如輻射狀迷宮和T迷宮中是常規(guī)要求。能提供較多試驗(yàn)參數(shù)，系統(tǒng)全面地考查試驗(yàn)動(dòng)物空間認(rèn)知加工過程，客觀地反應(yīng)其認(rèn)知水平。將試驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶障礙和感覺、運(yùn)動(dòng)缺陷等分離開來，減少它們對(duì)學(xué)習(xí)記憶過程檢測(cè)干擾。既能夠檢測(cè)空間參照記憶又能夠檢測(cè)空間工作記憶。在用固定平臺(tái)測(cè)試小鼠空間參照記憶后再將平臺(tái)位置改為不固定，就可檢測(cè)它們工作記憶能力。顯然，尋找不固定平臺(tái)認(rèn)知過程要復(fù)雜某些，需要?jiǎng)游飳?duì)時(shí)間和空間上分離信息加以整合和判斷。操作簡便，數(shù)據(jù)誤差較小。第55頁Morris水迷宮不足之處由于需要監(jiān)視系統(tǒng)及分析軟件，只有少數(shù)裝備較好試驗(yàn)室能夠?qū)嵭?。試?yàn)程序設(shè)計(jì)需要考慮原因較多，同步需要試驗(yàn)者具有一定神經(jīng)生理學(xué)、認(rèn)知生理學(xué)和數(shù)理統(tǒng)計(jì)方面知識(shí)，給試驗(yàn)開展和成果解釋帶來困難，同步也限制了該迷宮深入廣泛應(yīng)用。由于體力消耗太大，體溫也喪失過多，年老體弱鼠完成任務(wù)較困難。并非所有鼠株都適合于Morris迷宮測(cè)試，如BALB/c不能學(xué)會(huì)該任務(wù)（成績并不隨天數(shù)增加而進(jìn)步），129/SvJ學(xué)習(xí)成績也偏差。個(gè)體間成績差異巨大。某些株，如129/SvJ株小鼠由于有年紀(jì)有關(guān)性視路病變(visualpathology)，在衰老時(shí)完成以視覺為基礎(chǔ)學(xué)習(xí)記憶任務(wù)時(shí)就會(huì)出現(xiàn)困難。在C57BL/6株，由于嚴(yán)重禿頭癥（alopecia）存在，也許使某些小鼠產(chǎn)生抑郁，加上潰瘍性皮炎，最后也許影響小鼠游泳能力而影響試驗(yàn)成績。對(duì)輕微學(xué)習(xí)記憶能力減退，該迷宮程序也許不敏感。所占試驗(yàn)場(chǎng)地過大。第56頁LashleyIII水迷宮第57頁LashleyIII水迷宮

是一種相對(duì)復(fù)雜迷宮。它具有動(dòng)物必須學(xué)會(huì)避免盲端（culs-de-sac）和動(dòng)物必須做出正確左或右拐彎T選擇。試驗(yàn)進(jìn)行5天，每天進(jìn)行2次測(cè)試（上下午各1次）。每天2次測(cè)試被平均。指標(biāo)包括：學(xué)習(xí)指數(shù)（正確進(jìn)入數(shù)/進(jìn)入總數(shù)）、游向目標(biāo)時(shí)盲端進(jìn)入數(shù)及T選擇錯(cuò)誤數(shù)、向后進(jìn)入總數(shù)、逃生所用時(shí)間等。第58頁八臂放射狀旱迷宮八臂放射狀旱迷宮，是Olten和Samnelson在1976年設(shè)計(jì)，做為一種評(píng)定大鼠空間學(xué)習(xí)記憶辦法。它能夠同步評(píng)定試驗(yàn)動(dòng)物工作記憶和參照記憶。原理利用食物作為鼓勵(lì)措施而達(dá)到目標(biāo)地，饑餓動(dòng)物需要實(shí)行尤其搜索次序或利用最短時(shí)間或最小錯(cuò)誤來謀求獎(jiǎng)賞。第59頁八臂放射狀旱迷宮裝置八臂放射狀旱迷宮是由從中央平臺(tái)伸出8個(gè)相等臂呈放射狀排列組成，8臂中有4臂末端放有食物，在同一天整個(gè)試驗(yàn)過程中哪些臂中具有食物保持固定不變，但每天之間都有變化。迷宮周圍有若干空間線索。試驗(yàn)前大鼠需被剝奪食物和水，試驗(yàn)開始時(shí)，大鼠被放在中央平臺(tái)處后去尋找食物。在試驗(yàn)中大鼠需記住哪些臂已被摸索過，食物已被攝取，以避免再次進(jìn)入，從而在最短時(shí)間內(nèi)取得最大量食物。同步，在每天試驗(yàn)結(jié)束后，大鼠還必須放棄當(dāng)天記憶信息，以準(zhǔn)備適應(yīng)第二天試驗(yàn)。第60頁八臂放射狀旱迷宮應(yīng)用評(píng)定動(dòng)物工作記憶和參照記憶

工作記憶是指利用一種僅僅在短時(shí)間內(nèi)保存信息，或稱為試驗(yàn)特定信息（trial-specificinformation）而取得記憶，它是對(duì)試驗(yàn)中可變事物記憶能力。

參照記憶是對(duì)連續(xù)存在信息，或稱為任務(wù)特定信息（task-specificinformation）記憶，它是對(duì)試驗(yàn)中不變事物記憶能力。第61頁八臂放射狀旱迷宮觀測(cè)指標(biāo)時(shí)間測(cè)定和錯(cuò)誤積分存在問題長處：同步評(píng)定試驗(yàn)動(dòng)物工作記憶和參照記憶不足：氣味影響。包括食物氣味、其他動(dòng)物氣味以及動(dòng)物本身氣味。試驗(yàn)動(dòng)物被限制食物和水，由此會(huì)帶來影響。并且不一樣食物獎(jiǎng)賞也可產(chǎn)生顯著影響；另外，動(dòng)物種屬不一樣使其在食物需求上也可造成不一樣結(jié)論。第62頁穿梭箱試驗(yàn)試驗(yàn)裝置試驗(yàn)箱大小為50cm×16cm×18cm。箱底部格柵為能夠通電不銹鋼棒，箱底中央部有一高1.2cm擋板，將箱底部分隔成左右兩列。試驗(yàn)箱頂部有光源，蜂鳴音控制器。訓(xùn)練時(shí)，將大白鼠放入箱內(nèi)任何一側(cè)，20s后開始展現(xiàn)燈光和（或）蜂鳴音，連續(xù)15s，后10s內(nèi)同步給以電刺激(100V，O.2mA，50Hz，AC)。最初，動(dòng)物只對(duì)電擊有反應(yīng)，即逃至對(duì)側(cè)以回避電擊。20s后再次出現(xiàn)條件刺激并繼之在動(dòng)物所在側(cè)施以電刺激，迫使動(dòng)物跳至另一側(cè)……如此來往穿梭。當(dāng)蜂鳴音或／燈光信號(hào)展現(xiàn)時(shí)，大白鼠立即逃至對(duì)側(cè)安全區(qū)以躲避電擊，即以為出現(xiàn)了條件反應(yīng)(或稱積極回避反應(yīng))。每閑天訓(xùn)練一回，每回100次。約訓(xùn)練4—5回后．動(dòng)物積極回避反應(yīng)率可達(dá)80％～90％。此法可同步觀測(cè)被動(dòng)和積極回避性反應(yīng).另外．從動(dòng)物反應(yīng)次數(shù)也能夠理解動(dòng)物系處于興奮或抑制狀態(tài)。第63頁穿梭箱試驗(yàn)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)能夠輸出下列內(nèi)容：(1)動(dòng)物序號(hào)；(2)遭受刺激次數(shù)；(3)遭受刺激時(shí)間；(4)積極回避反應(yīng)時(shí)間。以上各值均為在設(shè)定穿梭次數(shù)內(nèi)反應(yīng)總和。遭受電激次數(shù)是被動(dòng)回避次數(shù)，該值與設(shè)定循環(huán)次數(shù)之差即為積極回避次數(shù)；刺激時(shí)間是指動(dòng)物在被動(dòng)回避過程受到電刺激時(shí)間和，該值愈小，說明動(dòng)物被動(dòng)反應(yīng)愈敏捷，積極回避時(shí)間是指動(dòng)物在接收條件刺激時(shí)間長短，該值越短，說明動(dòng)物積極回避反應(yīng)越迅速．第64頁跳臺(tái)試驗(yàn)

跳臺(tái)試驗(yàn)屬一次性刺激回避反應(yīng)試驗(yàn)（ONETRAILAVOIDANCETEST）。裝置：試驗(yàn)裝置為一長方形反射箱，大小為10cm×10cm×60cm，用黑色塑板分割成5間。地面鋪以柵欄，間距0.5cm，能夠通電，每間角落置一高和直徑均為4.5cm平臺(tái)。第65頁跳臺(tái)試驗(yàn)原理

在一種開闊空間，動(dòng)物大部分時(shí)間都在邊緣及角落里活動(dòng)。在一種方形中心設(shè)置一種高平臺(tái)，當(dāng)把動(dòng)物放在平臺(tái)時(shí)，它幾乎立即跳下平臺(tái)并向四周摸索接近邊緣指標(biāo)潛伏期：統(tǒng)計(jì)動(dòng)物從上平臺(tái)到第一次下平臺(tái)時(shí)間操作步驟一種典型例子包括三個(gè)過程：熟悉過程

學(xué)習(xí)過程

記憶檢測(cè)熟悉過程：將動(dòng)物放在平臺(tái)上，開始計(jì)時(shí)，至動(dòng)物跳下。此時(shí)間段為潛伏期。動(dòng)物摸索10s后來，放回籠中學(xué)習(xí)過程：動(dòng)物一旦從平臺(tái)上跳下后，立即受到電刺激，然后放回籠中記憶檢測(cè)：學(xué)習(xí)試驗(yàn)24h后，將試驗(yàn)動(dòng)物重新放回平臺(tái)上，統(tǒng)計(jì)跳下平臺(tái)潛伏期。動(dòng)物跳下平臺(tái)或連續(xù)停留在平臺(tái)上標(biāo)志著驗(yàn)結(jié)束（終止時(shí)間為60s）。將動(dòng)物放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3min，然后立即通以36V交流電。動(dòng)物受到電擊，其正常反應(yīng)是跳回平臺(tái)以躲避傷害性刺激。多數(shù)動(dòng)物也許再次或數(shù)次跳至柵欄上，受到電擊后又迅速跳回平臺(tái)。如此訓(xùn)練5min，并統(tǒng)計(jì)每鼠受到電擊次數(shù)或叫錯(cuò)誤次數(shù)（numberoferrors），以此作為學(xué)習(xí)成績。24h后重做測(cè)試，此即叫記憶保持測(cè)試。統(tǒng)計(jì)受電擊死亡動(dòng)物數(shù)、第一次跳下平臺(tái)潛伏期和3min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)。第66頁三、電生理學(xué)辦法

電生理學(xué)辦法包括胞外統(tǒng)計(jì)、胞內(nèi)統(tǒng)計(jì)、腦內(nèi)電刺激、電壓鉗、膜片鉗、腦電圖等技術(shù)。1、電生理常用儀器

陰極射線示波器:高敏捷度，掃描速度慢

生物電放大器

電子刺激器

貯存和分析電生理試驗(yàn)成果儀器：如示波器照相機(jī)和計(jì)算機(jī)。第67頁2、電生理學(xué)常用辦法

細(xì)胞外統(tǒng)計(jì)(Extracellularrecording)：把引導(dǎo)電極安放在神經(jīng)組織表面或附近引導(dǎo)神經(jīng)組織電活動(dòng)。胞內(nèi)統(tǒng)計(jì)(Intracellularrecording)：研究神經(jīng)元基本生物物理特性有力伎倆。EPSP,IPSP,AP(動(dòng)作電位)腦內(nèi)電刺激：是研究中樞功能定位辦法之一。

第68頁順行沖動(dòng)統(tǒng)計(jì)法(Orthodromicimpulserecording)：就是電刺激某一突觸前細(xì)胞體、樹突或軸突，在此突觸后神經(jīng)元細(xì)胞體上統(tǒng)計(jì)此刺激引發(fā)電活動(dòng)變化。逆行沖動(dòng)統(tǒng)計(jì)法(Antidromicimpulserecording)：逆行沖動(dòng)統(tǒng)計(jì)法即電刺激神經(jīng)元軸突主干或末梢，在同一神經(jīng)元胞體統(tǒng)計(jì)反相傳導(dǎo)動(dòng)作電位。

第69頁電壓鉗技術(shù)(VoltageClamp)：通過插入細(xì)胞內(nèi)一根微電極向細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)充電流，補(bǔ)充電流量正好等于跨膜流出反向離子流，這樣雖然膜通透性發(fā)生變化時(shí)，也能控制膜電位數(shù)值不變。通過離子通道離子流與經(jīng)微電極施加電流方向相反，數(shù)量相等。

第70頁SG:信號(hào)發(fā)生器，F(xiàn)BA:反饋放大器，V監(jiān)測(cè)膜電位第71頁膜(斑)片鉗技術(shù)（PatchClamp）：能夠從分子水平研究細(xì)胞膜離子通道功能，是用玻璃微電極吸管和只含１～３個(gè)離子通道，面積為幾個(gè)平方微米細(xì)胞膜通過負(fù)壓吸引封接起來，由于電極尖端與細(xì)胞膜高阻封接，此片膜內(nèi)開放所產(chǎn)生電流流進(jìn)玻璃吸管，用一極敏感電流監(jiān)視器（斑片鉗放大器）測(cè)量此電流強(qiáng)度，就代表單一離子通道電流。第72頁膜片鉗（patchclamp）

內(nèi)爾(Neher)薩克曼(Sakmann)

（1944-）（1942-）（德國細(xì)胞生理學(xué)家）（德國細(xì)胞生理學(xué)家）

合作發(fā)明了膜片箝技術(shù)，并應(yīng)用這一技術(shù)初次證明了細(xì)胞膜上存在離子通道。這一成果對(duì)于研究細(xì)胞功能調(diào)控至關(guān)主要，可揭示神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及糖尿病等多種疾病發(fā)病機(jī)理，并提供治療新途徑。二人共獲1991年諾貝爾獎(jiǎng)。第73頁膜片鉗第74頁典型統(tǒng)計(jì)模式：貼附式（Cell-attached或oncell)

內(nèi)膜向外式(Inside-out)

外膜向外式(Outside-out)

全細(xì)胞統(tǒng)計(jì)方式(Whole-cellrecording)第75頁第76頁

第77頁第78頁腦電波測(cè)定:

用雙極或單極引導(dǎo)法，將引導(dǎo)電極放在腦活動(dòng)區(qū)顱骨表面之上，能夠統(tǒng)計(jì)出能變換方向薄弱電流。通過強(qiáng)力放大統(tǒng)計(jì)出來電位稱腦電圖（ＥＥＧ）。

第79頁誘發(fā)電位:

中樞神經(jīng)任何部位對(duì)于故意刺激感受器官，感受神經(jīng)、感覺通路上任何一點(diǎn)，或與感覺器官有關(guān)任何構(gòu)造上一點(diǎn)，所產(chǎn)生電變化，叫做誘發(fā)電位（evokedpotential)。

第80頁典型生物化學(xué)辦法包括：離心電泳層析質(zhì)譜等由于生物化學(xué)辦法與藥理學(xué)、免疫學(xué)等其他學(xué)科相結(jié)合，又發(fā)展了：放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)放射受體免疫印跡等方面四、生物化學(xué)辦法

第81頁1、用離心法分離制備突觸小體及突出小體膜突觸小體:是指腦組織在等滲溶液中勻漿時(shí)，神經(jīng)末梢細(xì)胞膜從軸突上自發(fā)斷裂、封閉而形成神經(jīng)末梢單位。它包括突觸前膜、突觸后膜及致密斑和包圍在突觸前膜突觸小泡(vesicle內(nèi)含神經(jīng)遞質(zhì))，線粒體及胞漿蛋白質(zhì)。由于突觸小體是神經(jīng)介質(zhì)及受體主要聚集部位，突觸小體制備便成了神經(jīng)介質(zhì)及受體基本制備伎倆。

第82頁離心（centrifuge）離心技術(shù)主要用于多種生物樣品分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大離心力作用，使懸浮微小顆粒（細(xì)胞器、生物大分子沉淀等）以一定速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒質(zhì)量、大小和密度。第83頁離心離心機(jī)種類制備型離心機(jī)

一般：（6000rpm下列）高速冷凍（25000rpm下列）超速（可達(dá)50000～80000rpm）分析型離心機(jī)第84頁離心制備型離心辦法差速沉降離心法

密度梯度區(qū)帶離心法（簡稱區(qū)帶離心法）

第85頁2、層析法:

特點(diǎn)：分離生物活性物質(zhì)時(shí)不使其失活，可大量制備。基本原理：被分離物質(zhì)與支持物互相作用緊密程度不一樣，流洗時(shí)被洗脫難易程度不一樣。

第86頁常用層析辦法離子交換層析凝膠過濾層析親和層析疏水層析高效液相第87頁第88頁離子交換層析第89頁凝膠過濾層析第90頁親和層析第91頁3、放射免疫(radioimmunoassay,RIA)測(cè)定神經(jīng)介質(zhì)：利用抗體(Ab)特異地識(shí)別其抗原（Ag）原理，將抗原標(biāo)識(shí)放射性同位素（*Ag），用來測(cè)定與*Ag抗原性相同物質(zhì)。

第92頁4、放射受體測(cè)定受體法：

利用標(biāo)識(shí)能作用于不一樣靶組織內(nèi)多種受體遞質(zhì)和激素，從而達(dá)成直接測(cè)定配體與其受體形成絡(luò)合物過程和理化特性。第93頁5、免疫印跡法（immunoblotting或westernblotting）判定生物分子：是將電泳凝膠分離出來電泳帶移到特殊濾膜上，再利用標(biāo)識(shí)抗體與濾膜上某一蛋白質(zhì)或肽特異結(jié)合，使其顯色。長處：一是將傳統(tǒng)電泳凝膠染色法敏感度提升了100~1000倍，二是RIA與相同，能從多種蛋白質(zhì)中選擇判定出一種特異蛋白質(zhì)，其敏感性可達(dá)1ng，同步又能懂得這一蛋白質(zhì)分子量，這又是RIA無法達(dá)成。第94頁6.電泳電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移過程。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)作用下，由于待分離樣品中多種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)差異，使帶電分子產(chǎn)生不一樣遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、判定或提純技術(shù)。電泳技術(shù)有很多種辦法，介紹最常用兩種：第95頁水平板式電泳槽垂直板式電泳槽穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀第96頁蛋白質(zhì)SDS電泳第97頁第98頁染色成果第99頁瓊脂糖凝膠電泳天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物組成中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)電滲現(xiàn)象。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。

瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、判定核酸:如重組質(zhì)粒判定，DNA酶譜制作等。第100頁瓊脂糖濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度/%線狀DNA大小/kb0.5

0.7

1.0

1.2

1.5

2.030-1

12-0.8

10-0.57-0.4

3-0.2

2-0.05第101頁凝膠制備與電泳第102頁樣品配制與加樣第103頁染色和拍照第104頁第105頁五、分子生物學(xué)辦法

１、神經(jīng)生物學(xué)研究中常用分子生物學(xué)辦法基因分子克隆克隆后基因在人工體外體現(xiàn)系統(tǒng)或細(xì)胞中體現(xiàn)克隆后基因作為探針研究基因體現(xiàn)組織特異性和發(fā)育階段特異性研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)構(gòu)造特性有助于理解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制

第106頁2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：在神經(jīng)生物學(xué)研究中有廣泛用途，如可應(yīng)用它發(fā)覺和分析新基因，測(cè)定mRNA

第107頁３、反向遺傳學(xué)利用制造體內(nèi)基因突變辦法研究基因及其產(chǎn)物功能：通過制造定向突變變化生物表型辦法與傳統(tǒng)遺傳學(xué)所采取通過生物表型確定其基因型辦法相反，故稱反向遺傳學(xué)。

第108頁４、遺傳連鎖分析法分離遺傳病基因：人類基因組由23條染色體組成，基因組內(nèi)大約包括5~10萬個(gè)基因，其中40%在腦內(nèi)體現(xiàn)。約有1000多種遺傳病具有顯著中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，占已知遺傳病總數(shù)三分之一。

第109頁六、腦成像（Brainimaging）技術(shù)

利用多