俄羅斯引進(jìn)馬鈴薯品種的分子身份證構(gòu)建

俄羅斯引進(jìn)馬鈴薯品種的分子身份證構(gòu)建

甘薯是谷物、蔬菜、飼料和工業(yè)材料的主要耕作單位。由于其廣泛的種植、高產(chǎn)量和高產(chǎn)量，它已成為世界第三糧食。其中,具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病等特性馬鈴薯品種的選育與推廣對促進(jìn)農(nóng)民增收和維護(hù)糧食安全發(fā)揮重要作用(盛萬民等,2013,馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與農(nóng)村區(qū)域發(fā)展,(7):122-124)。為提高育種效率,人們利用各種技術(shù)對其種質(zhì)資源開展廣泛的研究。隨著DNA標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展、特別是馬鈴薯SSR標(biāo)記引物序列的公開,國內(nèi)外學(xué)者對馬鈴薯品種遺傳基礎(chǔ)、種質(zhì)資源遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)的研究陸續(xù)有報(bào)道,極大促進(jìn)了馬鈴薯多態(tài)性研究,為馬鈴薯品種的鑒定提供廣闊的發(fā)展前景。McGregor等(2000)利用5對SSR分子標(biāo)記引物有效區(qū)分24份南美的馬鈴薯栽培品種。Norero等(2002)利用分子標(biāo)記技術(shù)對歐洲的37份馬鈴薯品種進(jìn)行了研究,用3對引物有效區(qū)分36份品種。Ghislain等(2004)利用156對SSR引物中篩選出的18對SSR多態(tài)性引物,可直接用于馬鈴薯種質(zhì)資源鑒定工作。徐敏(2007)利用SSR標(biāo)記技術(shù)對我國審定品種203份的馬鈴薯品種的遺傳多樣性研究,發(fā)現(xiàn)我國馬鈴薯品種群體結(jié)構(gòu)遺傳基礎(chǔ)較單一。段艷鳳等(2009)篩選出10對性能穩(wěn)定、多態(tài)性好的SSR引物,檢測分析了我國審定的88份馬鈴薯材料,發(fā)現(xiàn)我國同一地點(diǎn)育成的馬鈴薯親緣關(guān)系較近,遺傳基礎(chǔ)狹窄。趙光磊等(2015)從80對引物中篩選出34對多態(tài)性好引物標(biāo)記對黑龍江省34份馬鈴薯品種遺傳多樣性的進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)黑龍江省主栽馬鈴薯品種的遺傳距離小,遺傳多樣性低。上述研究表明,SSR分子標(biāo)記技術(shù)在馬鈴薯遺傳多樣性研究和品種鑒別方面愈加成熟,特別是國內(nèi)馬鈴薯品種的遺傳多樣性還較低。黑龍江省是中國馬鈴薯重要的生產(chǎn)和研發(fā)基地,馬鈴薯已逐漸主糧化,已成為該省的第四大作物(李成軍,2007,作物雜志,(4):13-16)。但是黑龍江省馬鈴薯品種的親本大多數(shù)引自歐洲的栽培種,少數(shù)含有原始栽培種和野生種的血緣,遺傳基礎(chǔ)非常狹窄(張麗娟等,2014,馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與小康社會建設(shè),(7):107-109)。俄羅斯與黑龍江省相鄰,氣候和地理?xiàng)l件相似,具有豐富的抗性基因及品質(zhì)性狀優(yōu)良的基因材料,是黑龍江省馬鈴薯種質(zhì)資源的重要引源地(金光輝等,2003,中國馬鈴薯,17(2):191-192)。近年來,黑龍江省從俄羅斯引進(jìn)的馬鈴薯品種資源具有品質(zhì)好,產(chǎn)量高,兼具抗旱、抗病等特點(diǎn),這些特性非常適合于黑龍江地區(qū)的馬鈴薯改良,但是有關(guān)這部分俄引資源的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)還沒有。因此,本研究以52份俄引馬鈴薯品種為試材,選用11份黑龍江省主栽品種為對照,利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對對其進(jìn)行多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析,以期為黑龍江省馬鈴薯育種親本選擇,創(chuàng)造新種質(zhì)提供分子遺傳學(xué)信息。1結(jié)果與分析1.1ssr位點(diǎn)基因信息分析分別選取6份黑龍江省和俄羅斯馬鈴薯品種進(jìn)行100對合成的SSR引物多態(tài)性擴(kuò)增預(yù)篩選。擴(kuò)增結(jié)果表明,有37對可擴(kuò)增出清晰穩(wěn)定的譜帶(圖1),有效擴(kuò)增率為37%。其中23對SSR引物具有多態(tài)性,多態(tài)性引物占23.0%,分布位于馬鈴薯4個染色體組的12條染色體上(表1)。上述引物在63份參試品種中共擴(kuò)增出86個等位基因,每對引物觀測等位基因2~5個,平均為3.7個(由于對SSR位點(diǎn)的人為識別較為嚴(yán)格,因此等位基因數(shù)相對較低)。其中STM0020和STI029觀測等位基因數(shù)最多,STM0029有效等位基因數(shù)最多,STM0025多態(tài)性信息含量最高。引物平均有效等位變異為3.6239個,平均有效等位變異比為0.9649,引物位點(diǎn)的多態(tài)信息含量指數(shù)(PIC)變幅為0.0339~0.6884,平均多態(tài)性信息含量為0.5285。說明所選用SSR引物在馬鈴薯上具有較高水平的多態(tài)性。1.2最優(yōu)k值的確定利用Structure軟件分析俄羅斯馬鈴薯的基因型群體結(jié)構(gòu),并且采用兩種方法來確定最優(yōu)K值。根據(jù)Pritchard等(2000)的方法,當(dāng)K值在6時(shí)達(dá)到最大值,表明最優(yōu)K值為6。基于Evanno等(2005)中提出的方法,當(dāng)K值為6時(shí),曲線具有最大的拐點(diǎn),最優(yōu)K值即為6(圖2)。根據(jù)以上兩種方法最終推斷出63份馬鈴薯基因型存在于6個獨(dú)立亞群中。1.3有供試材料的利用主成分分析進(jìn)一步驗(yàn)證Structure的群體結(jié)果。第一和第二主成分分別揭示總變異的17.9%和2.5%(圖3;圖4)。來源于俄羅斯的52份馬鈴薯品種也分為6個群體,黑龍江省的11份對照品種來源分布于其中的4個群體中。為了進(jìn)一步揭示俄羅斯馬鈴薯品種的群體分化與親緣關(guān)系,用MEGA軟件進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建了63份供試材料的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。所有供試材料可分為6個類群,其中第Ⅰ和第Ⅳ類中品種最多,分別為15份和19份,第Ⅱ和Ⅲ類中次之,分別12份和9份,而第Ⅴ和Ⅵ類中各只有四個品種。6個類群中都有俄羅斯品種,而黑龍江省的11份對照品種僅存在于其中的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ等4個類群中。其中在第Ⅰ類群有“克新4號”、“尤金”和“米拉”三個對照品種,說明這3個品種與俄引的“BE200158-3”、“BE200170-10”和“俄-13”等12個品種遺傳距離較近;在第Ⅱ類群中,只有一個對照品種“克新2號”,這表明,該品種與俄引的“гибрид59/m-56”、“Ранный”和“вир244”等11個品種遺傳距離較近;在第Ⅲ類群中“克新17號”、“夏波蒂”和“克新19號”與俄引的“Уладар”、“波S”和“俄薯泥”等6個品種遺傳距離較近;存在于第Ⅳ類群中“克新23號”、“克新1號”、“克新18號”和“克新13號”等四個對照品種與俄引的“гибрид728-6”、“波BR”和“гибрид569N”等15個品種遺傳關(guān)系較近;在Ⅵ和Ⅴ類群中不存在黑龍江省馬鈴薯品種,說明其中的8個俄引品種與黑龍江省主栽馬鈴薯品種遺傳距離較遠(yuǎn)。這些結(jié)果為俄引品種的雜交利用提供了數(shù)據(jù)信息。1.4分子身份證構(gòu)建根據(jù)電泳條帶大小用數(shù)字依次記錄其等位基因,利用IDAnalysis1.0軟件進(jìn)行分子身份證數(shù)據(jù)錄入和分析。主要分為兩種,一種是采用引物的特異性基因目標(biāo)條帶劃分品種,這類劃分的品種較少,其中,引物STM0046在材料14DEm23中顯示特異條帶2,引物STL047在材料14DEM11中顯示特異性條帶為0。由于在PCR分子檢測中具有特異等位基因片段的品種數(shù)量較少,另一種是采用多個引物的等位基因組合來劃分品種,研究結(jié)果表明,剔除5對不符合標(biāo)準(zhǔn)的引物,分別為STM0025,STL001,STL007,STM0038和STL057,1對引物相似系數(shù)過高,為STM0046,最后獲得分子身份證引物為STL029、STPOAC58、STM1106、STL047、STM0051、STM1030及STL004共7對,這些引物可將供試品種區(qū)分開,用于身份證構(gòu)建(表3)。以參試俄羅斯馬鈴薯品種“14DEM01”來說明,它的分子ID身份證是3121433,表示在STL029引物中存在第3個基因片段、在STPOAC58引物中存在第1個基因片段,在STM1106引物中存在第2個基因片段,在STL047引物中存在第1個基因片段,以此類推,到第7個STL004引物中存在第3個基因片段,這些基因片段組成了PCR分子指紋圖譜,其數(shù)字就構(gòu)成馬鈴薯品種的分子ID。通過軟件分析,最終利用引物STL029、STPOAC58、STM1106、STL047、STM0051、STM1030和STL004建立分子指紋圖譜(圖6)。利用篩選出的23對引物對每一個馬鈴薯品種進(jìn)行擴(kuò)增,根據(jù)擴(kuò)增片段大小用數(shù)字分別依次記錄其等位基因。將這些數(shù)據(jù)用GeneticsStatistics3.0軟件分析,獲得63份馬鈴薯的特異性指數(shù)(表2)。由特異性指數(shù)可見,品種間差異較大,介于150.762~273.970之間,平均為184.921。其中14DEM25特異性指數(shù)最低,為150.762,14DEM56特異性指數(shù)最高,為273.970。俄羅斯馬鈴薯的平均特征值為189.1213,而黑龍江省馬鈴薯的平均特征值為165.0627,低于俄羅斯馬鈴薯特征值。特異性指數(shù)經(jīng)卡方檢驗(yàn),材料間差異達(dá)到極顯著水平。2群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性本研究選用覆蓋全基因組23對SSR標(biāo)記對俄羅斯馬鈴薯品種進(jìn)行遺傳多樣性分析和電子身份證構(gòu)建。在實(shí)驗(yàn)中剔除了PCR擴(kuò)增目標(biāo)條帶不穩(wěn)定、多態(tài)性不高的引物后,最終所選用SSR引物的目標(biāo)條帶清楚、穩(wěn)定、多態(tài)性好且多態(tài)信息含量PIC>0.5,這表明這些SSR標(biāo)記具有高度的多態(tài)性位點(diǎn)。其中STI001、STI007、STI029、STM0025、STM1106和ST-POAC58等位點(diǎn)上表現(xiàn)較高的遺傳多樣性,這些位點(diǎn)能較好地反映了供試馬鈴薯品種的遺傳多樣性,適合應(yīng)用于俄羅斯馬鈴薯品種的遺傳多樣性檢測。遺傳多樣性的研究對馬鈴薯品種選育具有重要的指導(dǎo)意義。遺傳多樣性決定了馬鈴薯對環(huán)境的適應(yīng)能力和利用潛力(李為民等,2012;胡建斌等,2013)。分子遺傳信息為育種者充分了解資源材料的遺傳背景,并準(zhǔn)確選擇雜交親本,快速培育優(yōu)良新品種提供了有力支持。在本研究中俄羅斯的馬鈴薯的特異性指數(shù)為189.12,而9份黑龍省馬鈴薯的特異性指數(shù)為165.06,低于俄羅斯馬鈴薯的特征值,雖然,供試的黑龍江省品種較少,但是從中也可看出,俄羅斯馬鈴薯品種的遺傳多樣性還是比較高的,這與唐銘霞等(2010)研究的結(jié)果相一致,而國內(nèi)現(xiàn)有的馬鈴薯品種遺傳多樣性水平較低,品種間的遺傳差異較小,因此,俄羅斯資源的引進(jìn)會進(jìn)一步豐富我國馬鈴薯遺傳基礎(chǔ)。本研究利用STRUCTRURE、主成分分析和MEGA軟件聚類分析3種方法對俄羅斯馬鈴薯進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析,3種方法均顯示63份馬鈴薯可分為6個群體。其中俄羅斯馬鈴薯品種可以分為6個亞群,黑龍江省馬鈴薯分布在其中的4個亞群中,聚類分析顯示兩國品種的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,反映了品種之間的親本關(guān)系,也可反映品種之間在長期的栽培過程中的存在基因交流現(xiàn)象。如在第四亞群中(圖5),黑龍江省馬鈴薯DEM49(克新13號)和俄羅斯馬鈴薯DEM12(BE20413-22)親緣關(guān)系較近,聚在一起,可以直接反映參試材料的親緣關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)采用全基因組均勻分布的23對SSR引物馬鈴薯分子標(biāo)記,剔除了大量的SSR引物,從基因組的覆蓋程度和準(zhǔn)確程度來說,有了很大的提高,更能夠準(zhǔn)確地反映供試材料的多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。然而若要更全面反映兩國馬鈴薯品種的親緣關(guān)系及群體結(jié)構(gòu),則應(yīng)該將更多的馬鈴薯品種納入進(jìn)來。3材料和方法3.1主栽馬鈴薯品種為俄羅斯引進(jìn)馬鈴薯品種52份,以“克新1號”、“克新2號”和“克新19”等11份黑龍江省主栽馬鈴薯品種作為對照。供試材料均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種所馬鈴薯研究室提供(表3)。3.2ssr引物的選擇從每份無病菌侵染馬鈴薯試管苗中選擇5株生長良好的單株,取嫩葉混合后用CTAB法(張宏紀(jì)等,2008)分別提取基因組DNA。5倍稀釋后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,于-80℃超低溫冰箱保存。SSR引物序列信息來源于GrainGenes,在馬鈴薯栽培種每條染色體上平均選擇5-10標(biāo)記,共計(jì)100對引物,選擇標(biāo)記盡可能均勻分布于馬鈴薯染色體組(Milbourneetal.,1998;Feingoldetal.,2005;Bradshawetal.,2008)。上海生工生物工程有限公司合成了實(shí)驗(yàn)所用的SSR引物。3.3pcr擴(kuò)增taqna使用GeneAmpPCRSystem9700儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)總體積均為25μL,DNA模板5μL(濃度為50ng/uL),10×Buffer2μL,dNTP(25μmol/L)2μL,上游和下游引物(5μmol/uL)各1μL,TaqDNA聚合酶0.3μL,用超純水補(bǔ)充體系至25μL。擴(kuò)增條件:96℃預(yù)變性6min;94℃變性50s,57℃退火45s,72℃延伸60s,共40個循環(huán);72℃延伸11min;4℃保存。采用聚丙烯酰胺凝膠(非變性)電泳檢測PCR產(chǎn)物,印染后用相機(jī)照相并分析圖片。3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)陳慶山教授開發(fā)的資源特征IDAnalysis1.0分析軟件建立參試馬鈴薯品種分子ID身份證。利用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)開發(fā)的陳慶山教授遺傳統(tǒng)計(jì)GeneticsStatistics3.0分析軟件分析參試馬鈴薯品種特異性指