釀酒葡萄簡單序列重復(fù)分子身份證的構(gòu)建

釀酒葡萄簡單序列重復(fù)分子身份證的構(gòu)建

葡萄是葡萄科的一個(gè)分支。它分布在世界溫帶和亞熱帶。它不僅可以提供新鮮食物，還可以飲酒、創(chuàng)造飲料和提取干燥。這是一個(gè)重要的耕作因素。葡萄繁殖方式主要為無性繁殖,不同葡萄酒產(chǎn)區(qū)間互相引種,并對外來優(yōu)良新品種的引進(jìn),出現(xiàn)同名異物,同物異名等品種混淆問題,又因葡萄種間雜交過程中產(chǎn)生中間型和過渡型雜種的概率較高簡單序列重復(fù)(simplesequencerepeats,SSR)技術(shù)也稱微衛(wèi)星技術(shù),是目前廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定、保護(hù)、遺傳多樣性分析和遺傳圖譜建立等方面的DNA指紋圖譜分析技術(shù)。該技術(shù)具有共顯性、靈敏度高、多態(tài)性高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),可為植物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析,建立品種SSR指紋圖譜提供便利本研究選取新疆天山北麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)10個(gè)優(yōu)良紅白釀酒葡萄品種為試材,利用SSR標(biāo)記分析技術(shù),通過非變性聚丙烯酰胺凝膠擴(kuò)增片段圖譜,分析紅白釀酒葡萄品種之間的親緣關(guān)系,建立10個(gè)釀酒葡萄品種的分子身份證。1材料和方法1.1材料和試劑選取新疆天山北麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的10個(gè)優(yōu)良釀酒葡萄品種果實(shí)(表1),置于-80℃冰箱貯藏備用。1.2設(shè)備和設(shè)備測序列分析儀(3730XL),美國ABI公司;Veriti1.3.1葡萄總dna的質(zhì)量檢測根據(jù)葡萄特性,將傳統(tǒng)的十六烷基三甲基溴化銨法(hexadecyltrimethylammoniumbromide,CTAB)進(jìn)行改良,有效提高了葡萄總DNA的質(zhì)量。具體步驟參考齊玲倩等人的《水果果肉中總DNA提取方法的比較研究》1.3.2ssr-pcr擴(kuò)增本研究根據(jù)葡萄公共遺傳圖譜NCBI,確定選用12對國際通用的SSR引物用于PCR擴(kuò)增,引物序列見表2。釀酒葡萄普通SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng),采用25μL反應(yīng)體系,其中包含有MgSSR-PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5min;94℃變性50s,退火溫度60s,72℃延伸1min,共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸7min。SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,200V,120min。銀染顯色主要操作如下:染色15min,蒸餾水沖洗1~2次,顯色5min,再次用蒸餾水沖洗1~2次,直至條帶清晰為止。1.3.3pcr擴(kuò)增產(chǎn)物檢測綜合1.3.2非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜結(jié)果和經(jīng)濟(jì)成本角度考慮,最終選取多態(tài)性良好,重復(fù)性較好的5對SSR引物進(jìn)行正向引物的5'-FAM標(biāo)記,它們分別是VrZAG62,VrZAG79,VVMD5,VVMD27和VVS2。釀酒葡萄SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng),采用25μL反應(yīng)體系,其中包含有MgSSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物,采用毛細(xì)管電泳法進(jìn)行檢測。具體步驟如下:吸取990μLHIDI和10μLLIZ500進(jìn)行混勻,然后吸取10μL混合物加入到96孔反應(yīng)板中;迅速將96孔板置于平板離心機(jī)中,離心到500×g結(jié)束;對照上機(jī)檢測表,在96孔板對應(yīng)的孔中加入相對應(yīng)的50pg樣品;再次將96孔板置于平板離心機(jī)中,離心到500×g結(jié)束;使用封板膜密封96孔板,振蕩,再次離心到500×g結(jié)束;置于PCR儀中;變性程序?yàn)?8℃,5min,不加熱蓋,程序結(jié)束后立即冷卻96孔板;然后將96孔板置于平板離心機(jī)中,離心到2000×g結(jié)束;最后將PCR產(chǎn)物使用ABI3730XL全自動基因分析儀進(jìn)行檢測分析。1.3.4pcr擴(kuò)增聚類分析SSR-PCR產(chǎn)物通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染后拍照,根據(jù)電泳圖譜多態(tài)性條帶并賦值分析。相同電泳遷移率下的清晰條帶賦值為“1”,無擴(kuò)增條帶的記為“0”,擴(kuò)增條帶不清晰將不進(jìn)行統(tǒng)計(jì),最終得到0/1數(shù)據(jù)矩陣結(jié)果,再利用NTSYSpc2.10e軟件進(jìn)行后續(xù)分析,不同釀酒葡萄品種之間的遺傳相似系數(shù)利用NTSYSpc2.10e軟件得出結(jié)果。首先利用軟件中Similarity中的QualitativeDate功能計(jì)算不同品種間的遺傳相似系數(shù),然后采用非加權(quán)類平均法(unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmean,UPGMA)進(jìn)行聚類分析,最終利用Graphics功能得出聚類分析樹狀圖。根據(jù)SSR-PCR非變性聚丙烯酰胺凝膠圖譜,將所有品種不用引物的譜帶進(jìn)行有序編碼轉(zhuǎn)換,建立10個(gè)釀酒葡萄品種的分子身份證。根據(jù)每對引物對不同品種有效譜帶分子量大小,從小到大有序編碼為1~9,如果條帶數(shù)超過9條,依次增加A~Z進(jìn)行編碼。如果SSR引物在其中一個(gè)樣品中擴(kuò)增出多個(gè)等位片段,選擇分子量較小的分子量對其編碼根據(jù)ABI3730XL出現(xiàn)的峰圖與內(nèi)標(biāo)LIZ500進(jìn)行比較,根據(jù)峰面積和出峰時(shí)間得出每個(gè)樣品在SSR位點(diǎn)的片段大小,使用Genemapper軟件分析樣品SSR數(shù)據(jù),具體分析步驟參照尹玲等人的《我國新育成葡萄品種SSR指紋圖譜的建立》2結(jié)果與分析2.1ssr引物擴(kuò)增多態(tài)性根據(jù)葡萄果實(shí)特性改良的CTAB法提取總DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白儀測定樣品DNA的質(zhì)量,結(jié)果顯示樣品的DNA的濃度和純度已達(dá)到SSR分子標(biāo)記要求,并將所有樣品的DNA濃度稀釋至40ng/μL。SSR-PCR的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜顯示,所有品種擴(kuò)增條帶清晰。本試驗(yàn)利用12對SSR引物在供試材料中檢測到56個(gè)等位基因,SSR引物擴(kuò)增的條帶范圍為13~28條,平均17.75條。片段長度介于100~800bp,200~500bp擴(kuò)增片段較多。引物VVMD27擴(kuò)增出13條條帶,是擴(kuò)增條帶數(shù)最少的引物;VVMD8是擴(kuò)增條帶數(shù)最多的引物,多達(dá)28條。引物VrZAG64擴(kuò)增片段分子量范圍最大,為150~800bp;引物VVS2擴(kuò)增片段分子量范圍最小,為140~340bp。12對SSR引物共擴(kuò)增213條擴(kuò)增片段,均為多態(tài)性條帶,多態(tài)性百分率為100%,具體見表3。2.2測定結(jié)果及分析本研究根據(jù)圖譜結(jié)果,得出0/1矩陣統(tǒng)計(jì)結(jié)果,對不同品種之間的遺傳距離進(jìn)行了計(jì)算,結(jié)果見表4。10個(gè)釀酒品種中,不同樣品間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.67~0.85之間,平均遺傳相似系數(shù)為0.76。其中“赤霞珠”和“美樂”之間遺傳相似系數(shù)最高,為0.85,“小芒森”與“貴人香”,遺傳相似系數(shù)相對最低,為0.67。2.3紅葡萄種質(zhì)組成以所有樣品的擴(kuò)增圖譜為基礎(chǔ),根據(jù)0/1數(shù)據(jù)矩陣結(jié)果,使用NTSYSpc2.10e軟件進(jìn)行UPGMA法聚類分析得出10個(gè)釀酒葡萄品種的聚類樹狀圖,見圖1。結(jié)果顯示10個(gè)樣品在遺傳相似系數(shù)0.73處產(chǎn)生了分離,將所有10份試驗(yàn)樣品分成2類。第1個(gè)大類包含有所有的紅葡萄品種,占所有樣品的70%,當(dāng)遺傳相似系數(shù)是0.76時(shí),又分成了3個(gè)亞類,第1個(gè)亞類是“赤霞珠”和“美樂”,第2個(gè)亞類是“蛇龍珠”和“品麗珠”,均為歐亞種,這4個(gè)品種相對較近,原因是“品麗珠”是“赤霞珠”,“美樂”和“蛇龍珠”的親本之一。第3個(gè)亞類是“西拉”,“馬瑟蘭”和“小芒森”,其親緣關(guān)系與第1和第2個(gè)亞類相對較遠(yuǎn)。第2個(gè)大類包含白葡萄品種和麝香葡萄,在遺傳相似系數(shù)0.78時(shí),又分成了2個(gè)亞類,第1個(gè)亞類有“霞多麗”和“貴人香”,第2個(gè)亞類是“玫瑰香”,單獨(dú)為一個(gè)分支。2.4釀酒葡萄分子身份證編碼12對引物對10個(gè)釀酒葡萄品種擴(kuò)增的等位基因譜帶大小分布范圍及賦值標(biāo)準(zhǔn)見表5。用篩選出的12對引物按照多樣性指數(shù)由低到高的順序進(jìn)行區(qū)分,其中前6對引物就可以區(qū)分所有的試驗(yàn)樣品,并構(gòu)建了10個(gè)釀酒葡萄品種分子身份證編碼,具體見表1。在所有引物擴(kuò)增的結(jié)果中,每個(gè)品種最少有1個(gè)特異等位基因,如引物VrZAG79擴(kuò)增結(jié)果顯示,“赤霞珠”,“美樂”,“西拉”,“馬瑟蘭”和“霞多麗”均有1個(gè)特異等位基因。如引物VVS2擴(kuò)增結(jié)果顯示,“霞多麗”,“貴人香”,“玫瑰香”,“小芒森”,“蛇龍珠”,“西拉”和“馬瑟蘭”均有1個(gè)特異等位基因。2.5毛細(xì)管電泳檢測5對5'-FAM標(biāo)記的SSR引物VrZAG62,VrZAG79,VVMD5,VVMD27和VVS2,對所有供試品種進(jìn)行毛細(xì)管電泳?；诿總€(gè)引物PCR產(chǎn)物片段大小,根據(jù)毛細(xì)管電泳峰圖的峰型以及每個(gè)峰值的大小建立,10個(gè)不同釀酒葡萄品種基于5對SSR引物的分子標(biāo)記圖譜,圖2為部分釀酒葡萄品種在熒光標(biāo)記VrZAG79位點(diǎn)上的毛細(xì)管電泳譜圖。3釀酒葡萄品種ssr指紋圖譜的構(gòu)建及其應(yīng)用隨著分子標(biāo)記技術(shù)和基因測序技術(shù)的快速發(fā)展,隨機(jī)擴(kuò)增片段多態(tài)性(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)、SSR、簡單序列重復(fù)區(qū)間(inter-simplesequencerepeat,ISSR)和單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)等分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于物種的起源、演化以及遺傳變異等相關(guān)研究,在水稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性能夠反映個(gè)體在特定生長環(huán)境下基因的豐富程度,是品種種質(zhì)研究工作中的基礎(chǔ),因此品種間親緣關(guān)系分析和指紋圖譜構(gòu)建對于品種選育,鑒定和保護(hù)有重要意義利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建葡萄品種的DNA指紋圖譜,可為保護(hù)優(yōu)良葡萄品種種質(zhì)資源、鑒定和檢測葡萄品種及其葡萄酒真實(shí)性和純度提供了客觀科學(xué)的參考依據(jù)。DNA指紋圖譜分析常用的方法為特征譜帶法和引物組合法,兩者結(jié)合則大大提高了鑒別效率。成冰等人利用14對SSR引物對13個(gè)釀酒白葡萄品種進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示特異性條帶率為25.00%,其中,VrZAG79條帶總數(shù),多態(tài)性條帶和特異性條帶均為最多,且所有品種的遺傳差異性較大。2個(gè)引物VrZAG62和VVIb66可分別鑒定所有試驗(yàn)品種本試驗(yàn)利用12對SSR引物對10個(gè)釀酒葡萄品種進(jìn)行了遺傳多樣性研究,由親緣關(guān)系遠(yuǎn)近將其分成2個(gè)類群。并依據(jù)所有樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜,選用6對引物對所有試驗(yàn)材料進(jìn)行了分子身份證編碼,研究表明SSR標(biāo)記從分子水平上解析