提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定

一、試驗?zāi)繕?、學習和掌握電泳（PAGE和SDS）基本原理及電泳技術(shù)。2、熟練掌握SDS相關(guān)試劑配制技術(shù)。3、了解SDS垂直板電泳法基本原理及操作技術(shù)。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第1頁二、試驗原理電泳概念：帶電粒子在電場中向與其本身帶相反電荷電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳(electrophoresis，簡稱EP)。用電泳技術(shù)分離、分析蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子，有較高分辨率，當前已成為生物科學研究中必不可少伎倆之一。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第2頁影響電泳主要原因

影響泳動速度原因：（1）顆粒性質(zhì)：普通說來，顆粒帶凈電荷量越大，或其直徑越小，或其形狀越靠近球形，在電場中泳動速度就快。反之，則越慢。（2）電場強度：電場強度越高，帶電顆粒泳動速度越快。反之，則越慢。（3）pH值：對蛋白質(zhì)而言，溶液pH值離其等電點愈遠，其帶凈電荷量就愈大，從而泳動速度就越快。反之，則越慢。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第3頁（4）離子強度：溶液離子強度普通在0.02～0.2mol/kg之間電泳較適當。若離子強度過高，則會降低顆粒泳動度。其原因：帶電顆粒能把溶液中與其電荷相反離子吸引在自己周圍形成離子擴散層。這種靜電作用結(jié)果，造成顆粒泳動速度降低，則緩沖能力差，往往會因溶液pH值改變而影響泳動速率。（5）溶液粘度：泳動度與溶液粘度是成反百分比關(guān)系。所以，粘度過大或過小，必定影響泳動速度。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第4頁（6）電滲：當支持物不是絕對惰性物質(zhì)時，經(jīng)常會有離子基團如羧基、磺酸基、羥基等吸附溶液中正離子，使靠近支持物溶液相對帶電。在電場作用下，此溶液層會向負極移動。反之，若支持物離子基團吸附溶液中負離子，則溶液層會向正極移動。溶液泳動現(xiàn)象稱為電滲。當顆粒泳動方向與電滲方向一致時，則加緊顆粒泳動速度；當顆粒泳動方向與電滲方向相反時則降低顆粒泳動速度。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第5頁（7）焦耳熱：電泳過程中釋放熱量與電流強度平方成正比。當電流強度或電極緩沖液中離子強度增高時，電流強度會伴隨增大。這不但降低分辨率，而且在嚴重時會燒斷濾紙或融化瓊脂糖凝膠支持物。（8）篩孔：支持物瓊脂和聚丙烯酰胺凝膠都有大小不等篩孔，在篩孔大凝膠中溶質(zhì)顆粒泳動速度快。反之，則泳動速度慢。除上述影響泳動速度因子外，溫度和儀器裝置等因子影響也應(yīng)考慮。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第6頁聚丙烯酰胺凝膠電泳：是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體一個區(qū)帶電泳。這種凝膠是由丙烯酰胺單體(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N，Nˊ-甲叉雙丙烯酰胺(N，Nˊ-methylenabisacrylamide，簡稱Bis)，在催化劑作用下聚合而成。Acr和Bis在它們單獨存在或混合在一起時是穩(wěn)定，但在含有自由基團體系時，它們就聚合。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第7頁聚丙烯酰胺凝膠聚合體系有兩種，化學聚合和光聚合?；瘜W聚合：引發(fā)劑是過硫酸銨[(NH4)2S2O3](簡稱Ap)，催化劑是N，N，Nˊ，Nˊ-四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，簡稱TEMED)。在催化劑TEMED作用下，由過硫酸銨(Ap)形成氧自由基，后者又使單體形成自由基，從而引發(fā)聚合作用。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第8頁TEMED在低pH時失效，會使聚合作用延遲。冷卻（低溫）也可使聚合速度變慢。一些金屬抑制聚合，分子氧阻止鏈延長，妨礙聚合作用。這些原因在實際操作時都應(yīng)給予控制。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第9頁光聚合：以光敏感物核黃素(即VB2)作為催化劑，在痕量氧存在下，核黃素經(jīng)光解形成無色基，無色基被氧再氧化成自由基，從而引發(fā)聚合作用。過量氧會阻止鏈長增加，應(yīng)防止過量氧存在。光聚合形成凝膠孔徑較大，而且伴隨時間延長而逐步變小，不太穩(wěn)定，所以用它制備大孔徑濃縮膠較為適當。采取化學聚合形成凝膠孔徑較小，而且重復(fù)性好，慣用來制備分離膠。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第10頁聚丙烯酰胺基本結(jié)構(gòu)為丙烯酰胺單位組成長鏈，鏈與鏈之間經(jīng)過甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起。鏈間縱橫交織，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠含有分子篩性能。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品擴散運動，使凝膠含有良好抗對流作用。另外，長鏈上富含酰胺基團，使其成為穩(wěn)定親水凝膠。該結(jié)構(gòu)中不帶電荷，在電場中電滲現(xiàn)象極為微小。這些特點，使得聚丙烯酰胺尤其適于作區(qū)帶電泳支持介質(zhì)。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第11頁聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量主要由凝膠濃度和交聯(lián)度決定。凝膠濃度：用T％表示每100mL凝膠溶液中含有單體(Acr)和交聯(lián)劑(Bis)總克數(shù)。交聯(lián)度：用C％表示凝膠溶液中，交聯(lián)劑(Bis)占單體(Acr)和交聯(lián)劑(Bis)總量百分數(shù)。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第12頁凝膠濃度(T)選擇與被分離物質(zhì)分子量親密相關(guān)。表3.4分子量范圍與凝膠濃度關(guān)系分子量范圍 適用凝膠濃度/(%)

蛋白質(zhì)

104 20-30 1-4×104 15-20

1-5×104-1×105 10-15

1×105 5-10

5×105 2-5 核酸(RNA)

104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第13頁改變凝膠濃度(T％)和交聯(lián)度(C％)，可取得不一樣密度、粘度、彈性、機械強度和孔徑大小凝膠，方便適應(yīng)各種樣品分離。普通慣用7.5％濃度聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，用2.4％分離核酸。但依據(jù)蛋白質(zhì)與核酸分子量不一樣，適用濃度也不一樣。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第14頁聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacryamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE）依據(jù)其有沒有濃縮效應(yīng)分為連續(xù)、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中，緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下主要有電荷及分子篩效應(yīng)。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第15頁不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中，因為緩沖液離子成份、pH、凝膠濃度及電位梯度不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不但有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)還含有濃縮效應(yīng)。下面就這三種物理效應(yīng)分別加以說明。(l)電荷效應(yīng)：各種樣品分子按其所帶電荷種類及數(shù)量，在電場作用下向一定電極，以一定速度泳動。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第16頁(2)分子篩效應(yīng)：分子量或分子大小和形狀不一樣樣品分子，經(jīng)過一定孔徑分離膠時，受妨礙程度不一樣而表現(xiàn)出不一樣遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。分子量小，形狀為球形分子在電泳過程中受到阻力較小，移動較快。分子量大，形狀不規(guī)則分子，電泳過程中受到阻力較大，移動較慢。這種效應(yīng)與凝膠過濾過程中情況不一樣。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第17頁(3)濃縮效應(yīng)：待分離樣品中各組分在濃縮膠中會被壓縮成層，而使原來很稀樣品得到高度濃縮。其原因以下：①因為兩層凝膠孔徑不一樣，樣品向下移動到兩層凝膠接口時，阻力突然加大，速度變慢，這么就在兩層凝膠交界處使待分離樣品區(qū)帶變窄，濃度升高。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第18頁

②在聚丙烯酰胺凝膠中，即使?jié)饪s膠和分離膠用都是Tris-HCl緩沖液。上層濃縮膠pH為6.7下層分離膠pH為8.9HC1是強電解質(zhì)，不論在哪層膠中，HCl幾乎都發(fā)生電離，C1-充滿整個膠體。待分離樣品加在頂部，浸在pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液中。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第19頁電泳一開始，有效泳動率最大Cl-快速跑到最前邊，成為快離子(前導(dǎo)離子)。在pH6.7條件下解離度僅有0.1～1％甘氨酸有效泳動率最低，跑在最終面，成為慢離子(尾隨離子)。這么，快離子和慢離子之間就形成了一個不停移動接口。在pH6.7條件下帶有負電荷樣品，其有效泳動率介于快慢離子之間，被夾持分布于接口附近，逐步形成一個區(qū)帶。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第20頁

圖4電泳過程示意圖

A為電泳前3層凝膠排列次序，3層膠中都有快離子，慢離子

B顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄區(qū)帶。C顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。

提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第21頁圖5不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應(yīng)示意圖

提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第22頁在pH6.7凝膠緩沖體系中前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出氯根(C1-)尾隨離子(trailingion)或慢離子：甘氨酸根

mcl

cl>mp

p>mG

GCl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根有效遷移率=m

，m為遷移率，

為解離度因為快離子快速向前移動，在其原來停留那部分地域成了低離子濃度區(qū)，及低電導(dǎo)區(qū)。電位梯度V、電流強度I和電導(dǎo)率S之間有以下關(guān)系：V=I/S提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第23頁在電流恒定條件下，低電導(dǎo)區(qū)兩側(cè)就產(chǎn)生了較高電位梯度，使樣品和甘氨酸慢離子加速前進，追趕快離子。在這個追趕中被逐步地壓縮聚集成一條更為狹窄區(qū)帶。這就是濃縮效應(yīng)。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第24頁當樣品分子和慢離子都進入分離膠后，pH從6.7變?yōu)?.9，甘氨酸解離度劇增，有效遷移率快速加大到超出全部樣品分子，從而趕上并超出全部樣品分子。此時，不連續(xù)高電位梯度不再存在。在分離膠電泳過程中，樣品在一個均一電位梯度和pH條件下，僅按電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)而被分離。與連續(xù)系統(tǒng)相比，不連續(xù)系統(tǒng)分離條帶清楚度及分辨率大大提升，所以已成為當前廣泛使用分離分析伎倆。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第25頁蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時．它遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子大小和形狀等原因。1967年，Shapiro等人發(fā)覺，假如在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate，簡稱SDS)，則蛋白質(zhì)分子電泳遷移率主要取決于它分子量Mr，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第26頁SDS測定蛋白質(zhì)分子量Mr原理SDS是一個陰離子表面激活劑，在蛋白質(zhì)溶液里加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵還原；SDS能使蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵打開并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。在一定條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)結(jié)合百分比為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)。因為十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質(zhì)SDS-復(fù)合物都帶上相同密度負電荷，它量大大超出了蛋白質(zhì)原有電荷量，因而掩蓋了不一樣種類蛋白質(zhì)間原有電荷差異。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第27頁SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引發(fā)了蛋白質(zhì)構(gòu)象改變。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物流體力學和光學性質(zhì)表明，它們在水溶液中形狀，近似于雪茄煙形長橢圓棒，不一樣蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物短軸長度都一樣，約為1.8nm，而長軸則隨蛋白質(zhì)Mr成正比改變?；谏鲜鲈?，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠電泳中遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀影響，而只與橢圓棒長度相關(guān)，也就是蛋白質(zhì)Mr函數(shù)。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第28頁當?shù)鞍踪|(zhì)分子量在15,000～200,000之間時，樣品遷移率與其分子量對數(shù)呈線性關(guān)系。符合以下方程式：LgMW=－b

mR+K

MW：蛋白質(zhì)分子量，mR：相對遷移率，b：斜率，K：截距。當條件一定時，b與K均為常數(shù)

已知分子量蛋白與未知蛋白比較，就能夠得出未知蛋白分子量提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第29頁LgMW=－b

mR+K提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第30頁用SDS測定蛋白質(zhì)Mr應(yīng)注意問題：1．假如蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物不能到達1.4SDS／lg蛋白質(zhì)比率并含有相同構(gòu)象，就不能得到準確結(jié)果。影響蛋白質(zhì)和SDS結(jié)合原因主要有以下3個：(1)二硫鍵是否完全被還原：只有在蛋白質(zhì)分子內(nèi)二硫鍵被徹底還原情況下，SDS才能定量地結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上去，并使之含有相同構(gòu)象?！阋詭€基乙醇作還原劑。在有些情況下，還需深入將形成巰基烷基化，以免在電泳過程中重新氧化而形成蛋白質(zhì)聚合體提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第31頁(2)溶液中SDS濃度：溶液中SDS總量，最少要比蛋白質(zhì)量高3倍，普通需高達10倍以上。(3)溶液離子強度：溶液離子強度應(yīng)較低，最高不能超出0.26，因為SDS在水溶液中是以單體和分子團混合體而存在.SDS結(jié)合到蛋內(nèi)質(zhì)分子上量，僅決定于平衡時SDS單體濃度而不是總濃度.在低離子強度溶液中，SDS單體含有較高平衡濃度。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第32頁2．不一樣凝膠濃度適合用于不一樣Mr范圍.Weber試驗指出，在5%凝膠中，Mr為25000～200000蛋白質(zhì)，其Mr對數(shù)與遷移率呈直線關(guān)系；在10％凝膠中，Mr為10000～70000蛋白質(zhì)，其Mr對數(shù)與遷移率呈直線關(guān)系；在15％凝膠中，Mr為10000～50000蛋白質(zhì)，其Mr對數(shù)與遷移率呈直線關(guān)系；3.33％(以上各種濃度凝膠，其交聯(lián)度都是2.6%)凝膠可用于Mr更高蛋白質(zhì)。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第33頁Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第34頁可依據(jù)所測Mr范圍選擇最適凝膠濃度，并盡可能選擇Mr范圍和性質(zhì)與待測樣品相近蛋白質(zhì)作標準蛋白。標準蛋白質(zhì)相對遷移率(蛋白質(zhì)電泳遷移距離除以染料遷移距離即為相對遷移率)最好在0.2～0.8之間均勻分布。在凝膠電泳中，影響遷移率原因較多，而在制膠和電泳過程中，極難每次都將各項條件控制得完全一致，所以用SDS凝膠電泳法測定Mr，每次測定樣品必須同時做標準曲線，而不得利用另一次電泳標準曲線。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第35頁

3．有許多蛋白質(zhì)，是由亞基(如血紅蛋白)或兩條以上肽鏈(如胰凝乳蛋白酶)組成，它們在SDS和疏基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈。對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-凝膠電泳測定只是它們亞基或單條肽鏈Mr，而不是完整分子Mr。

為了得到更全方面資料，還必須用其它方法測定其Mr及分子中肽鏈數(shù)目等，與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果相互參考。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第36頁4．不是全部蛋白質(zhì)都能用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定其Mr.已發(fā)覺電荷異?；驑?gòu)象異常蛋白質(zhì)，帶有較大輔基蛋白質(zhì)(如一些糖蛋白)以及一些結(jié)構(gòu)蛋白（如膠原蛋白等）用這種方法測定出Mr是不可靠。如組蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，盡管結(jié)合了正常量SDS，仍不能完全掩蓋其原有電荷影響。它Mr是21000，但SDS-凝膠電泳測定結(jié)果卻是35000。所以，要確定某種蛋白質(zhì)分子量時，最好用兩種方法相互驗證，則更為可靠。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第37頁三．試驗材料試驗二所得純化菠蘿蛋白酶樣品，低分子量標準蛋白樣品四．儀器設(shè)備夾心式垂直板電泳槽、直流穩(wěn)壓電電泳儀、恒溫水浴鍋、微量加樣器、移樣器、電爐等。五．玻璃器皿100mL燒杯，吸管、玻棒，移液管或移液器5mL、1mL、0.5mL，漏斗，濾紙，試劑瓶（1000mL、500mL、250mL等）。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第38頁六．試驗試劑要求：（1）SDS—PAGE幾個試劑配制，嚴格按照各試劑特點和要求配制。（2）低分子量標準蛋白樣品配制。（3）待測純化蛋白質(zhì)樣品處理。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第39頁試驗試劑配制

(1)30%凝膠貯液：取30g丙烯酰胺（Acr）、0.8g甲叉雙丙烯酰胺(Bis),（先用約50mL蒸餾水溶解，如溶解不了,可加熱30℃～50℃溶解,再用量筒定容至100mL，然后過濾，后置于棕色瓶。4℃下保留備用）。(2)10%過硫酸銨(AP)溶液：取2g過硫酸銨溶解后，定容至20mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。(3)1mol/LHCl500mL：取濃HCl42mL，加蒸餾水至500mL(在通風櫥中操作)。(4)分離膠緩沖溶液（1.5mol/LTris-HCl緩沖液，pH8.8）:取18.15gTris溶解后，加1mol/LHCl溶液約48mL，調(diào)pH至8.8,定容至100mL(Tris為三羥甲基氨基甲烷或緩血酸銨)。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第40頁(5)濃縮膠緩沖液(0.5mol/LTris-HCl緩沖液,pH6.8):取6gTris溶解后，加1mol/LHCl溶液40mL，調(diào)pH至6.8，定容至100mL(Tris為三羥甲基氨基甲烷或緩血酸銨)。(6)10%SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液:取5gSDS加水定容至50mL。（加熱溶解）(7)電極緩沖液(0.1%SDS–0.05mol/LTris–0.384mol/L甘氨酸緩沖液，pH8.3):取6gTris，28.8g甘氨酸(氨基乙酸)和1gSDS加水溶解后，調(diào)pＨ值至8.3，定容至１000mＬ（配好試劑其pＨ為8.3）(12個組可配濃縮2倍母液5升,使用時再稀釋.)。

提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第41頁(8)樣品溶解液：取SDS２g，β-巰基乙醇５mL，甘油10mL，溴酚藍0.1g，0.5mol/L，Tris–HCl緩沖液,pＨ6.8(即上述濃縮膠緩沖液)10mL，加蒸餾水25mL，(最終總體積為50mL),裝于棕色瓶。(9)染色液（0.1%考馬斯亮藍-45%甲醇-10%冰乙酸溶液）：1g考馬斯亮藍R250，加入450mL甲醇、100mL冰乙酸，用水定容至1000mL。(12個組可配mL)(10)脫色液（0.25mol/LNaCl）：取14.6gNaCl，加水定容至1000mL(12個組可配3000mL)。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第42頁七．試驗步驟1、清洗并吹干玻璃板。2、在塑料膠條兩面涂少許凡士林（注意不能涂多，以防弄臟玻璃板）。3、安裝好電泳槽（玻璃板）。4、封膠：用小燒杯加6mL蒸餾水，2mL30%凝膠儲液，200uL10％TEMED（原液），200uL10％過硫酸銨（AP），混勻，用滴管滴加于封口槽處，靜置約10min直到凝固。5、加dH2O于兩層玻璃之間，檢驗玻璃底是否漏水；假如漏水，要重裝。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第43頁圖2夾心垂直板電泳槽示意圖

圖3凝膠模示意圖

1.樣品槽模板2.長玻璃板1.導(dǎo)線接頭2.下貯槽3.凹形橡膠框

4.樣品槽模板5.固定螺絲6.上貯槽7.冷凝系統(tǒng)

返回提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第44頁12%分離膠5%濃縮膠

30%凝膠貯液4000μl810μl上層膠緩沖液pH6.8—2500μl下層膠緩沖液pH8.85000μl—TEMED（四甲基乙二胺)10μl7μl10%SDS100μl50μldH2O0.65μl1500μlAP（過硫酸氨）0.15μl70μl提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第45頁6、用小燒杯按下表1配下層膠（分離膠），膠濃度為12%，混勻，灌膠，高度離梳子約1～1.5cm，然后覆蓋一層水，凝膠時間為15～30min，膠與水分層，傾倒去水。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第46頁

*水封膠作用：保持分離膠上沿平直，排氣泡

*膠凝好標志：膠與水層之間形成清楚界面

7、用小燒杯按上表1配上層膠（濃縮膠），膠濃度為５％，混勻，灌膠，插入梳子。

*梳子需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第47頁8、在凝膠過程中，液面下降，要補充膠液，凝膠時間約10～20min，凝好膠，拔掉梳子。9、加入稀釋電極緩沖液，浸泡至上槽（低玻璃面），但不能超出下槽（高玻璃面），注意不能漏水。*用吸管將加樣孔內(nèi)和玻璃板下面放密封條位置氣泡全部排出10、加熱樣品（沸水浴數(shù)處理3min）。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第48頁11、微量注射器按下表2點樣，隔孔點樣，注意不要交叉污染（每點一個樣都要清洗微量注射器）。表2點樣方式孔1234567891011加樣粗酶標準蛋白過柱1過柱2過柱3體積μL30～4030353535*微量注射器不可過低,以防刺破膠體；也不可過高,樣品下沉時易發(fā)生擴散，溢出加樣孔提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第49頁12、上槽接負極（－），下槽接正極（＋）。13、恒電壓電泳：濃縮膠，80V，約1h；分離膠，160V，約3h。14、取膠，做好記號（左→右）。15、染色（新配染色液只需染50℃20～30min），回收染色液。16、脫色：加脫色液50℃2～3h處理，或常溫脫色數(shù)天,即可看到條帶。剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第50頁提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第51頁17、拍照并畫電泳圖譜，計算標準蛋白、待測樣品相對遷移率蛋白相對遷移率＝蛋白遷移距離/指示劑遷移距離18、用低分子量標準蛋白質(zhì)所作標準曲線，求待測樣品亞基相對分子量。以標準蛋白質(zhì)電泳相對遷移率為橫坐標(X)，標準蛋白質(zhì)分子量對數(shù)為縱坐標(Y)，繪標準蛋白質(zhì)標準曲線，再依據(jù)樣品相對遷移率在曲線上求出其蛋白質(zhì)分子量。提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第52頁蛋白名稱遷移距離相對遷移率（Y）蛋白分子量(D)蛋白分子量對數(shù)(X)兔磷酸化酶B97400牛血清白蛋白66200牛碳酸酐酶43000牛蛋白酶抑制劑31000雞蛋清溶菌酶0過柱菠蘿蛋白酶14400指示劑------提純菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定第53頁低分子量標準蛋白質(zhì)組分：1)兔磷酸化酶B分子量97,400(道爾頓)2)牛血清白蛋白分子量