克氏原螯蝦血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)研究

克氏原螯蝦血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)研究

胞養(yǎng)結(jié)合劑對(duì)克氏原螯蝦胞免疫的作用克羅伊斯托納通常是一種常見的甲殼類動(dòng)物。作為自身神經(jīng)系統(tǒng)的主要組成部分之一，它對(duì)克羅伊斯托納的正常生長(zhǎng)活動(dòng)和體液免疫以及細(xì)胞免疫起到了重要而不可替代的作用。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1鈉的合成試驗(yàn)藥品:姬姆薩染色液、蘇丹Ⅲ染液、丙三醇、甲醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、戊二醛、蔗糖、無水乙醇、70%酒精、檸檬酸、葡萄糖、EDTA、檸檬酸三鈉。試驗(yàn)器材:水族缸、1mL注射器、量筒、燒杯、恒溫箱、玻片、蓋玻片、電子天平、移液管、移液槍、玻璃棒、記號(hào)筆、血球計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)表、顯微鏡、鑷子。1.1.2試驗(yàn)材料及分組挑選肢體完整、無機(jī)械損傷、無病害、無畸形、個(gè)體大小基本一致的克氏原螯蝦為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)前將克氏原鰲蝦在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)160h左右,每天定時(shí)定量投喂龍蝦飼料和更換暫養(yǎng)水1～2次,試驗(yàn)時(shí)挑選出50只體表完好無損、無病、活動(dòng)能力強(qiáng)的克氏原鰲蝦作為試驗(yàn)對(duì)象。1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.2.1玻片的下一步染色取兩片干凈的載玻片輕輕置放在玻片臺(tái)上面,先用移液槍吸取固定劑0.02mL(1%的蔗糖、1%的戊二醛,定容至100mL)滴在其中一張玻片的一端,然后從克氏原鰲蝦心臟吸取0.01mL的血液快速滴在先前滴有固定劑的干凈玻片上,輕輕將另一張玻片傾斜放置于克氏原螯蝦心臟血滴左端(玻片的置放角度以30°～45°最適宜),向右均勻地將玻片推進(jìn)至另一端,傾斜4°固定30min后,對(duì)涂片進(jìn)行下一步的染色處理。1.2.2抗菌染色法血涂片制作好之后,可以采用GIMESA染色、瑞氏染色、蘇丹Ⅲ染色、PAS染色對(duì)血涂片進(jìn)行進(jìn)一步的染色處理。經(jīng)過染色處理后,血細(xì)胞中的嗜堿性顆粒會(huì)被染色劑著染成為藍(lán)色,而嗜酸性顆粒則會(huì)被著染成為橙紅色;血細(xì)胞中如果含有脂質(zhì)成分將會(huì)被著染為橘紅色;細(xì)胞中的多糖成分將被著染為粉紅色。1.2.3紅細(xì)胞dhc不同類型外周血計(jì)數(shù),dhc和dhc總血紅蛋白a的計(jì)數(shù)將血涂玻片靜置干燥后放置于100倍油鏡的光學(xué)顯微鏡下觀察血細(xì)胞中的顆粒、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的染色和分布情況。觀察3種不同種類血細(xì)胞的數(shù)量,每張涂片最少觀察300～500個(gè)細(xì)胞,并做好相關(guān)記錄,作為DHC原始數(shù)據(jù)。吸取500μL抗凝劑于Eppendorf離心管中,同時(shí)在離心管中注入500μL克氏原鰲蝦血液,之后迅速將抗凝劑和克氏原螯蝦血液混合均勻,用Neubauer氏血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),作為THC原始數(shù)據(jù)。1.2.4統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)一律采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)。2結(jié)果與分析2.1細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞數(shù)量在光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色后的血涂片進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)致觀察,根據(jù)顯微鏡下觀察到的血涂片中克氏原螯蝦血細(xì)胞的形狀、大小,血細(xì)胞胞質(zhì)中顆粒的大小、數(shù)量、折光性以及血細(xì)胞經(jīng)過染色處理后顏色變化情況等對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行大致分類,可以將克氏原螯蝦的血細(xì)胞分為三大類型,即透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、大顆粒細(xì)胞。透明細(xì)胞(hyalinecell,HC),一般近圓形,少量呈不規(guī)則多邊形,GIMESA染色和瑞氏染色后細(xì)胞核呈現(xiàn)淡藍(lán)色,細(xì)胞核在整個(gè)細(xì)胞中居中或稍微偏離中間位置,細(xì)胞質(zhì)幾乎呈現(xiàn)透明狀態(tài),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)類似顆粒狀物質(zhì)。蘇丹Ⅲ染色結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)不含脂質(zhì)成分,PAS染色結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)含有多糖成分。通過比較發(fā)現(xiàn),透明細(xì)胞在三種細(xì)胞中個(gè)體相對(duì)最小,但核質(zhì)比最高,并且透明細(xì)胞中有一個(gè)相對(duì)較大的核;三類細(xì)胞相比之下,小顆粒細(xì)胞與大顆粒細(xì)胞內(nèi)部顆粒的數(shù)量均相對(duì)較多。小顆粒細(xì)胞(semi-granularcell,SGC),一般為月牙形或紡錘形,少量呈橢圓形。經(jīng)GIMESA染色和瑞氏染色后細(xì)胞核呈淡藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)無色,細(xì)胞質(zhì)中含少量分布不均勻的淡藍(lán)色小顆粒,多數(shù)集中在細(xì)胞兩端。蘇丹Ⅲ和PAS染色結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)不含脂質(zhì)成分而含有多糖成分。大顆粒細(xì)胞(granularcell,GC),一般為長(zhǎng)橢圓形,極少量呈紡錘形。GIMESA染色和瑞氏染色后細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)淡紅色,且含有大量分布均勻的橙紅色顆粒。光鏡下能觀察到大量折光性較強(qiáng)的大顆粒物質(zhì),染色后細(xì)胞核呈現(xiàn)深藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)淡紅色。長(zhǎng)時(shí)間觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞核在細(xì)胞中有時(shí)會(huì)受到較多顆粒物質(zhì)的擠壓,經(jīng)常處于偏離中間位置的狀態(tài)。蘇丹Ⅲ和PAS染色結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)不含脂質(zhì)成分而含有多糖成分。2.2類細(xì)胞所占比例的比較在光學(xué)顯微鏡下對(duì)6片克氏原螯蝦血細(xì)胞血涂片進(jìn)行觀察并測(cè)量其血細(xì)胞的大小,分別對(duì)三類細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞直徑透明細(xì)胞最小,為7.51μm,小顆粒細(xì)胞次之,為8.75μm,大顆粒細(xì)胞最大,為11.29μm。三類細(xì)胞在整個(gè)血細(xì)胞中所占百分比最大的為透明細(xì)胞,占整個(gè)血細(xì)胞的64.3%,其次是大顆粒細(xì)胞,占整個(gè)血細(xì)胞的20.2%,最小的是小顆粒細(xì)胞,占整個(gè)血細(xì)胞的15.5%。整個(gè)克氏原螯蝦血細(xì)胞總數(shù)為(6.35±1.17)×103結(jié)論和討論3.1染色方法對(duì)蝦類組織學(xué)檢測(cè)的影響學(xué)術(shù)界在蝦類血細(xì)胞的分類與組成研究領(lǐng)域中存在非常大的分歧,各種細(xì)胞所占比例也存在有很大的差異。根據(jù)相關(guān)研究分析,產(chǎn)生分歧的關(guān)鍵原因在于不同研究人員所采用的研究方法和分類的標(biāo)準(zhǔn)不同。因此建立可靠、方便的染色方法有助于蝦類免疫學(xué)的研究。對(duì)克氏原螯蝦不同種類血細(xì)胞形態(tài)的觀察能為甲殼類動(dòng)物研究學(xué)家研究甲殼類動(dòng)物免疫防御機(jī)制提供關(guān)鍵信息。3.2不同克氏原蝦血流量分析3.2.1類細(xì)胞所占比例的分析研究采用GIME-SA染色、瑞氏染色、蘇丹Ⅲ染色、PAS染色方法將克氏原螯蝦的血細(xì)胞分為三類,分別是透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、大顆粒細(xì)胞,三種細(xì)胞在整體中所占比例分別為64.3%、15.5%、20.2%,由大到小依次為小顆粒細(xì)胞>大顆粒細(xì)胞>透明細(xì)胞,與周暉等3.2.2關(guān)于克氏原鰲蝦的生長(zhǎng)血細(xì)胞的THC數(shù)量與周暉等的研究結(jié)果略有差異,原因可能與試驗(yàn)對(duì)象棲息環(huán)境不同有關(guān)。通常養(yǎng)殖人員錯(cuò)誤地認(rèn)為克氏原鰲蝦在污水中具有較強(qiáng)的生存能力,就表明其具有很強(qiáng)的抗病能力。但是目前的高密度養(yǎng)殖與以往克氏原鰲蝦的生存條件具有很大的差異,此次試驗(yàn)克氏原鰲蝦均來自封閉的小水體池塘,水質(zhì)條件相對(duì)較差。3.2.3克氏原鰲蝦紅細(xì)胞的染色