紙層析法分離氨基酸專家講座

紙層析法分離氨基酸

紙層析法分離氨基酸專家講座第1頁試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

1、掌握分配層析原理，學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法操作技術(shù)(包含點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、判定及定量)。2、學(xué)習(xí)未知樣品氨基酸成份(水解、層析及判定)分析方法。紙層析法分離氨基酸專家講座第2頁試驗(yàn)原理

層析法又叫色層分離法、色譜分析法或色譜法。1944年應(yīng)用濾紙作為固定支持物“紙層析”誕生以來，層析技術(shù)發(fā)展越來越快，五十年代開始，相繼出現(xiàn)了氣相色譜和高壓液相層析，其它如薄層層析、親合層析、凝膠層析等也迅猛發(fā)展。層析分離技術(shù)操作簡(jiǎn)便，樣品用量可大可小，既可用于試驗(yàn)室分離分析，又適合用于工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)品分析制備。現(xiàn)已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程等學(xué)科廣泛應(yīng)用而又必不可少分析工具之一。紙層析法分離氨基酸專家講座第3頁分配層析

分配層析法是利用不一樣物質(zhì)在兩個(gè)互不相溶溶劑中分配情況不一樣而使之得到分離方法。分配層析法中不一樣溶質(zhì)分離取決于其在兩相(固定相和流動(dòng)相)間分配系數(shù)不一樣。分配系數(shù)(K)定義是：K=溶質(zhì)在固定相濃度(CS)/溶質(zhì)在流動(dòng)相濃度(CL)紙層析法分離氨基酸專家講座第4頁二、紙層析(一)原理

紙上層析實(shí)際上是以濾紙纖維結(jié)合水為固定相，而以有機(jī)溶劑(與水不相混溶或部分混溶)作為流動(dòng)相。展開時(shí)，有機(jī)溶劑在濾紙上流動(dòng)，樣品中各物質(zhì)在兩相之間不停地進(jìn)行分配。因?yàn)楦魑镔|(zhì)有不一樣分配系數(shù)，移動(dòng)速度所以不一樣，從而到達(dá)分離目標(biāo)。

紙層析法分離氨基酸專家講座第5頁紙層析法分離氨基酸專家講座第6頁溶質(zhì)在濾紙上移動(dòng)速率可用Rf值表示：Rf=X/Y式中X：溶質(zhì)斑點(diǎn)中心移動(dòng)距離Y：溶劑前沿移動(dòng)距離Rf值決定于分配系數(shù)。不一樣物質(zhì)分配系數(shù)不一樣，Rf值也不相同，由此能夠依據(jù)Rf值大小對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

紙層析法分離氨基酸專家講座第7頁(二)影響Rf值主要原因

物質(zhì)結(jié)構(gòu)和極性

物質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子極性是影響Rf值主要原因。極性較大物質(zhì)，在水中溶解度較大，其Rf值就較小，反之亦然。2.濾紙

不一樣濾紙厚薄程度和纖維松緊度各不相同，所以結(jié)合水量不一樣，兩相體積比也就不一樣。所以同一個(gè)物質(zhì)在不一樣型號(hào)濾紙上進(jìn)行層析時(shí)，所得到Rf值也不相同。另外，濾紙上所含雜質(zhì)也會(huì)影響Rf值。

紙層析法分離氨基酸專家講座第8頁3.層析所用溶劑

同一物質(zhì)在不一樣溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行層析時(shí)，Rf值不一樣。所以溶劑配制和使用必須嚴(yán)格，才能使Rf值重現(xiàn)性好。在好溶劑系統(tǒng)中被分離物質(zhì)Rf值應(yīng)在0.05-0.85之間，樣品中被分離組分Rf之差最好大于0.05。溶劑系統(tǒng)中試劑若純度不夠，需經(jīng)過預(yù)處理后才能使用。處理方法因溶劑性質(zhì)而異。慣用處理方法有：酸、堿抽提，水洗滌，重蒸餾，脫水干燥等紙層析法分離氨基酸專家講座第9頁4.pH值

溶劑和樣品pH值會(huì)影響物質(zhì)解離，從而影響物質(zhì)極性和溶解度，使Rf值改變。溶劑酸堿度增大則流動(dòng)相含水量增高，使極性物質(zhì)Rf值增加；反之則降低。為了防止或降低pH值對(duì)Rf值影響，可將濾紙和溶劑用緩沖溶液處理，使之保持一定pH值。5.溫度

溫度能影響物質(zhì)在兩相中溶解度，即影響分配系數(shù)；也影響濾紙纖維水合作用，即影響固定相體積.所以溫度改變使Rf值改變很大，為此，層析必須在恒溫條件下進(jìn)行。

紙層析法分離氨基酸專家講座第10頁6.展開方式

同一物質(zhì)在其它層析條件完全相同情況下，用不一樣展開方式進(jìn)行層析時(shí)，所得到Rf值不相同。用下行法展開時(shí)，Rf值較大；用上行法展開時(shí)，Rf值較??；用圓形濾紙層析時(shí)，因?yàn)閮?nèi)圈較外圈小，限制了溶劑流動(dòng)，Rf值也較小。7.樣品溶液中雜質(zhì)

樣品溶液中存在雜質(zhì)時(shí)，有時(shí)對(duì)Rf值有所影響。比如：氯化鈉存在會(huì)影響氨基酸Rf值。紙層析法分離氨基酸專家講座第11頁(三)操作方法

1.樣品處理

用作紙層析樣品，應(yīng)盡可能除雜純化。調(diào)整到一定pH值，濃度太低可用真空濃縮提升濃度，濃度太高則需稀釋。2.點(diǎn)樣

將濾紙裁成適當(dāng)大小，用鉛筆在距邊線2cm左右劃一直線(稱為原線)，線上每隔2-3cm劃一圓點(diǎn)(稱為原點(diǎn))。然后用點(diǎn)樣器(定性分析可用普通毛細(xì)管，定量分析需用微量注射器)輕輕點(diǎn)在原點(diǎn)上。樣品點(diǎn)直徑約0.3-0.5cm。點(diǎn)樣量應(yīng)依據(jù)紙長(zhǎng)短以及樣品性質(zhì)來決定，普通每一樣品量為5-30μg。點(diǎn)樣普通采取少許屢次，每點(diǎn)一次必須用冷風(fēng)吹干，然后再點(diǎn)第二次。每次點(diǎn)樣位置應(yīng)完全重合，不然會(huì)出現(xiàn)斑點(diǎn)畸形現(xiàn)象。紙層析法分離氨基酸專家講座第12頁紙層析法分離氨基酸專家講座第13頁3.平衡

點(diǎn)樣以后展開以前先將濾紙與層析缸用配好溶液系統(tǒng)蒸汽來飽和，這個(gè)過程稱之為“平衡”。若不經(jīng)平衡，濾紙和層析缸未被溶劑蒸汽飽和，在層析過程中，濾紙會(huì)從溶劑中吸收水分，溶劑也會(huì)從濾紙表面揮發(fā)，從而改變?nèi)軇┫到y(tǒng)組成,嚴(yán)重影響層析效果。平衡普通在密閉層析缸內(nèi)進(jìn)行。紙層析法分離氨基酸專家講座第14頁4.展開

平衡結(jié)束后，將濾紙靠樣品點(diǎn)一端浸入溶劑中，溶劑液面距原線距離約1cm，此時(shí)即開始展開。當(dāng)溶劑前沿抵達(dá)濾紙另一端0.5-1cm處時(shí)，展開結(jié)束，取出濾紙，在溶劑前沿處做一標(biāo)識(shí)，晾干或用冷風(fēng)吹干。按溶劑在濾紙上流動(dòng)方向不一樣，展開有上行、下行和環(huán)行三種方式。(1)上行法：將濾紙點(diǎn)樣一端向下浸入溶劑中，溶劑因毛細(xì)管引力作用從下向上流動(dòng)。上行法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，是最慣用展開方法，但展開時(shí)間較長(zhǎng)。(2)下行法：在層析缸上部有一盛展開劑液槽，將濾紙點(diǎn)樣一端朝上浸入槽中，溶劑主要靠重力作用自上而下流動(dòng)。下行法展開速度快，但Rf值重現(xiàn)性較差，斑點(diǎn)易擴(kuò)散。紙層析法分離氨基酸專家講座第15頁

(3)環(huán)行法：又稱水平法，樣品點(diǎn)于圓形濾紙距圓心1cm左右環(huán)形線(原線)上。濾紙水平放置，溶劑由濾紙條引向圓心，然后不停向四面水平方向流動(dòng)。因?yàn)槿軇┫驁A周方向擴(kuò)散，所以展開圖譜呈弧形。用環(huán)行法展開時(shí)，最好使用無方向性特制濾紙。（4）雙向展開法：假如樣品組分較多，用一個(gè)溶劑系統(tǒng)（常為酸性）不能將各組分全部分開時(shí)，可將樣品點(diǎn)在方形濾紙一角，用一個(gè)溶劑系統(tǒng)展開后吹干溶劑，將濾紙轉(zhuǎn)動(dòng)90o后再用另一個(gè)溶劑系統(tǒng)（常為堿性）展開，這稱為“雙向展開法”。

紙層析法分離氨基酸專家講座第16頁5.顯色

為了顯示層析斑點(diǎn)位置，可依據(jù)物質(zhì)性質(zhì)不一樣，采取顯色劑顯示或紫外光顯示。(1)顯色劑顯示：被分離物質(zhì)與顯色劑生成有顏色化合物，顯示斑點(diǎn)位置。慣用噴霧法、浸漬法或涂刷法。(2)紫外光顯示：有些物質(zhì)有紫外光吸收性質(zhì)，如核苷酸類物質(zhì)。有些物質(zhì)受紫外光照射會(huì)發(fā)出熒光，如維生素B1、B2等，所以可在紫外光照射下觀察到被分離物質(zhì)斑點(diǎn)。6.定性分析

層析后斑點(diǎn)顯示出來后，計(jì)算出各斑點(diǎn)Rf值，就能夠?qū)ξ镔|(zhì)進(jìn)行定性。紙層析法分離氨基酸專家講座第17頁7.定量分析

對(duì)被分離物質(zhì)進(jìn)行定量方法很多，慣用有：(1)剪洗比色法：將斑點(diǎn)剪下，用適當(dāng)溶劑洗脫后，經(jīng)過分光光度計(jì)進(jìn)行比色定量。(2)直接比色法：用特制分光光度計(jì)直接測(cè)量濾紙上斑點(diǎn)顏色濃度，畫出曲線，由曲線所包含面積可求出待測(cè)物含量。(3)面積測(cè)量法：試驗(yàn)證實(shí)，圓形或橢圓形斑點(diǎn)面積與物質(zhì)含量對(duì)數(shù)成正比。所以，可用測(cè)量斑點(diǎn)面積方法求得物質(zhì)含量。紙層析法分離氨基酸專家講座第18頁紙層析法分離氨基酸專家講座第19頁試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)試劑1、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/mL)五種氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸,脯氨酸分別配制成一定濃度溶液。2、展開劑是：正丁醇：甲酸：水=15:3:2(正丁醇：水：乙酸=4：1：1)3、0.2%茚三酮丙酮溶液。4、氨基酸混合液(每種氨基酸500mg/mL)。紙層析法分離氨基酸專家講座第20頁試驗(yàn)器材:1、濾紙。2、培養(yǎng)皿(直徑115mm)。3、電熱鼓風(fēng)干燥箱。4、噴霧器及吹風(fēng)機(jī)。5、點(diǎn)樣管及點(diǎn)樣架。6、針、線、尺。7、燒杯(50mL)。紙層析法分離氨基酸專家講座第21頁試驗(yàn)操作

（一）、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸紙上層析1、單向上行層析(1)、氨基酸Rf值測(cè)定A、濾紙：選取國(guó)產(chǎn)濾紙，10cm×20cm，在距紙邊2cm處，用鉛筆輕輕劃一條線，于線上每隔2cm處畫一小圓圈作為點(diǎn)樣處，圈直徑不超出0.3cm。紙層析法分離氨基酸專家講座第22頁B、點(diǎn)樣：點(diǎn)樣要適當(dāng)，樣品點(diǎn)太濃，斑點(diǎn)易擴(kuò)散或拉長(zhǎng)，以致分離不清，氨基酸點(diǎn)樣量以每種氨基酸含5～20μg為宜，用點(diǎn)樣管(也可用血色素管代替)吸收氨基酸樣品10μg(1μg/μL)，與濾紙垂直方向輕輕碰觸點(diǎn)樣處中心，這時(shí)樣品就自動(dòng)流出。點(diǎn)樣擴(kuò)散直徑控制在0.3cm之內(nèi)，點(diǎn)樣過程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴，為使樣品加速干燥，可用一加熱裝置(如吹風(fēng)機(jī))，但要注意溫度不可過高，以免氨基酸破壞，尤其是谷氨酰胺破壞，影響定量結(jié)果。將點(diǎn)好樣品濾紙兩側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。注意縫線處紙兩邊不要接觸。防止因?yàn)槊?xì)管現(xiàn)象使溶劑沿兩邊移動(dòng)尤其快而造成溶劑前沿不齊，影響Rf值。紙層析法分離氨基酸專家講座第23頁C、展層：將揉成圓筒狀濾紙放入培養(yǎng)皿內(nèi)(注意濾紙不要碰皿壁)，當(dāng)溶劑展層至距離紙上沿約1cm時(shí)，取出濾紙，馬上用鉛筆標(biāo)出溶劑前沿位置，晾干，使紙上溶劑自然揮發(fā)，直至除凈溶劑。酸溶劑系統(tǒng)：正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2(體積比)，茚三酮5ml。溫度25℃，時(shí)間1h。注意：使用溶劑系統(tǒng)需新鮮配制，并要搖勻。展層溶劑每張約需25mL。紙層析法分離氨基酸專家講座第24頁D、顯色：待展層基本結(jié)束后,，置65℃鼓風(fēng)箱中10-20min，鼓風(fēng)保溫，濾紙上即顯出紫紅色/黃色斑點(diǎn)。紙層析法分離氨基酸專家講座第25頁E、Rf值計(jì)算：用尺測(cè)量顯色斑點(diǎn)中心與原點(diǎn)(點(diǎn)樣中心)之間距離和原點(diǎn)到溶劑前沿距離，求出此值，即得氨基酸Rf值。計(jì)算出5種氨基酸在酸系統(tǒng)