敲除meq基因的mdv感染性克隆在雞生產(chǎn)中的免疫保護作用

敲除meq基因的mdv感染性克隆在雞生產(chǎn)中的免疫保護作用

馬麗斯?。╩d）是由馬麗斯病病毒（mdv）引起的全球雞感染的一種病毒性疾病。主要特征是t淋巴結(jié)瘤、多發(fā)神經(jīng)炎和免疫抑制。馬立克氏病病毒可經(jīng)空氣傳播,傳染力很強,未經(jīng)免疫的易感雞群感染可造成很高的死亡率上述傳統(tǒng)的MDV疫苗對控制MD發(fā)揮了巨大作用,但是傳統(tǒng)疫苗卻存在著許多的缺點。MDV疫苗用原代雞胚成纖維細胞(chickenembryofibroblast,CEF)進行生產(chǎn),因此需要消耗大量SPF雞胚;同時由于MDV嚴格的的細胞結(jié)合特性導致在生產(chǎn)中不可能獲得足夠量的細胞游離病毒,因此目前廣泛使用的細胞結(jié)合型MDV疫苗必須與細胞保存于液氮中超低溫儲存和運輸本實驗室于2001年在中國廣西分離了一株MDV,命名為GX0101,以細菌人工染色體(bacterialartificialchromosomes,BAC)為載體我們成功地構(gòu)建了MDV中國流行株-GX0101的感染性克隆bacGX01011材料和方法1.1材料表面1.1.1f雞飼料和顆粒9-10日齡SPF雞胚購自濟南斯帕法斯家禽有限公司;CVI988/Rispens為商品疫苗株,MDV超強毒參考株rMd51.1.2質(zhì)粒提取和成像系統(tǒng)細胞培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司,T載體pMD18-T、限制性內(nèi)切酶等均購自TaKaRa公司,其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。凝膠回收試劑盒為美國OMEGA公司產(chǎn)品。質(zhì)粒提取試劑盒購自德國Qiagen公司。冷凍離心機、電轉(zhuǎn)儀、PCR儀和分光光度計購于Eppendorf公司。凝膠成像系統(tǒng)購于Bio-Rad公司。二氧化碳培養(yǎng)箱購于上海力申科學儀器有限公司。1.2gx0101meq-bac免疫感染5組雞的mdv細胞毒性檢測為了研究GX0101Δmeq-BAC作為DNA疫苗的免疫保護效果,將90只1日齡SPF雞隨機分為6組,每組15只,分別飼養(yǎng)于6個帶有正壓過濾空氣的SPF動物飼養(yǎng)隔離罩內(nèi)。1日齡,第1、2組雞以10μg/只的劑量大腿肌肉接種GX0101Δmeq-BAC,第3組雞以2000PFU/只的劑量腹腔接種CVI988/Rispens疫苗株,第4組雞以10μg/只的劑量大腿肌肉接種pDS-pHAI-US2質(zhì)粒作為免疫對照組,第5組雞大腿肌肉注射等體積的PBS緩沖液,作為攻毒對照組,第6組雞為空白對照組。第1組雞在免疫后12天以500PFU/只的劑量攻擊MDV超強毒rMd5,第2、3、4、5組雞均在免疫5天后以500PFU/只的劑量攻擊MDV超強毒rMd5。在免疫、攻毒后觀察各組雞的生長態(tài)勢,記錄各組雞只死亡情況并對死亡雞只剖檢,取疑似馬立克特有病變臟器做石蠟切片,HE染色,進行病理組織學觀察。在攻毒后13周,剖檢所有的存活雞,眼觀大體病變。同時分別取心臟、肝臟于10%中性福爾馬林固定,4℃保存。石蠟切片,HE染色,進行病理組織學觀察。GX0101Δmeq-BAC免疫感染rMd5組與CVI988/Rispens免疫感染rMd5組以及攻毒對照組雞死亡后剖檢觀察病變,記錄實驗期間的死亡率以及MD引起的病變情況。每一組雞的MD病變百分數(shù)由病變雞只數(shù)除以存活雞與死亡雞的總和乘以100得來。疫苗免疫效力由保護指數(shù)(protectionindex,PI)來確定,PI計算方法為攻毒對照組的雞產(chǎn)生MD病變百分數(shù)減去免疫組雞產(chǎn)生MD病變百分數(shù)再除以攻毒對照組雞產(chǎn)生MD病變百分數(shù)乘以1002結(jié)果2.1gx0101meq-bac免疫的臨床療效檢測各組雞在免疫攻毒后進行臨床觀察,在攻毒后13周處死并剖檢所有存活雞,進行肉眼觀察?？瞻讓φ战M雞群個體大小均勻,長勢正常。與空白對照組相比。第5組攻毒對照組與第4組pDS-pHAI-US2質(zhì)粒免疫組的雞感染rMd5后雞群個體消瘦且大小不均,羽毛粗亂、無光澤,生長發(fā)育遲緩;第5組攻毒對照組死亡14只雞,個別出現(xiàn)失明,雙側(cè)肢體癱瘓;內(nèi)臟出現(xiàn)嚴重的雞馬立克氏病特有的白色腫瘤結(jié)節(jié);pDS-pHAI-US2免疫對照組死亡13只雞,剖檢,內(nèi)臟出現(xiàn)嚴重的雞馬立克氏病典型病變,腫瘤明顯。CVI988/Rispens疫苗免疫組僅死亡1只雞,出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀,但剖檢沒有發(fā)現(xiàn)可眼觀的典型雞馬立克氏病病變,其余雞只均正常。GX0101Δmeq-BAC免疫12d后攻毒組,雞群個體大小均勻,長勢正常,有5只雞死亡,經(jīng)過剖檢,發(fā)現(xiàn)其內(nèi)臟有輕度的馬立克氏病癥狀,其余雞正常;免疫5d后攻毒組,雞大小不均,生長發(fā)育狀況差,有8只雞死亡,個體瘦弱,個別出現(xiàn)肢體麻痹現(xiàn)象,經(jīng)過剖檢發(fā)現(xiàn)有不同程度的脾臟、坐骨神經(jīng)腫大;腺胃黏膜出血、脫落;肝臟、脾臟、心臟出現(xiàn)較大的白色腫瘤結(jié)節(jié)等典型的馬立克癥狀。各組雞免疫攻毒后的存活率曲線(圖1)。2.2gx0101meqbac免疫海蘭多克隆抗體對雞細胞增殖的影響為了更細致客觀的評價GX0101Δmeq-BAC的保護性,整個實驗過程,每組死亡雞或最后處死雞均做剖檢,并取心臟、肝臟做石蠟切片,進行組織病理學觀察,部分病理圖片見圖2,與空白對照組雞的內(nèi)臟器官切片相比;GX0101Δmeq-BAC免疫12d后攻毒組心肌纖維正常,心肌纖維間有較少量的淋巴細胞浸潤;免疫5d后攻毒組存活雞心肌纖維正常,心肌纖維間有少量的淋巴細胞浸潤但淋巴細胞未聚集成灶,未形成腫瘤結(jié)節(jié),死亡雞只心肌纖維間大量的大中小淋巴細胞集聚成灶,取代正常心肌纖維細胞。CVI988/Rispens免疫組絕大多數(shù)心肌纖維正常,無任何病變,極少數(shù)有微量淋巴細胞浸潤。pDS-pHAI-US2免疫組與攻毒對照組切片顯示心肌纖維萎縮,間質(zhì)增寬,大中小淋巴細胞在心肌纖維間浸潤性生長、壓迫,取代正常心肌纖維細胞。GX0101ΔmeqBAC免疫后12d攻毒組與空白對照組相比肝細胞索間較少量的淋巴細胞浸潤;免疫后5d攻毒組肝細胞索間質(zhì)增寬,其間少量的淋巴細胞浸潤,個別區(qū)域淋巴細胞聚集成病灶。CVI988/Rispens免疫組肝細胞有輕微的顆粒變性。pDS-pHAI-US2免疫組與攻毒對照組切片顯示大中小淋巴細胞形成的腫瘤灶壓迫并取代正常肝組織,同時可見腫瘤細胞周邊肝細胞壞死、崩解,被淋巴細胞取代?？傮w來講,攻毒對照組與pDS-pHAI-US2質(zhì)粒免疫組組織損傷明顯,切片全部呈現(xiàn)不同嚴重程度的馬立克特有組織學病變,顯示馬立克特有病變切片比例為30/30。CVI988/Rispens免疫組有3/30的切片顯示輕度的馬立克特有組織學病變。在GX0101Δmeq-BAC免疫后5d攻毒,有19/30的切片顯示不同嚴重程度的馬立克特有組織學病變,免疫后12d攻毒,顯示馬立克特有病變切片比例為12/30。2.3gx0101meq-bac免疫后感染rd5的情況通過在GX0101Δmeq-BAC免疫后不同時間攻擊超強毒rMd5觀察GX0101Δmeq-BAC對SPF雞的保護效果,同時比較了GX0101Δmeq-BAC作為侯選DNA疫苗和CVI988/Rispens疫苗的保護率。各組雞在整個實驗過程中的死亡情況及各疫苗的保護效果見表1。攻毒對照組與pDS-pHAI-US2質(zhì)粒免疫對照組表現(xiàn)出100%的雞馬立克氏病特有的死亡和損傷現(xiàn)象;同期CVI988/Rispens免疫后感染rMd5的SPF雞群則表現(xiàn)出13%的雞馬立克氏病特有的死亡和損傷現(xiàn)象,CVI988/Rispens對超強毒rMd5的保護指數(shù)可達到87%。GX0101Δmeq-BAC免疫5d后感染rMd5組表現(xiàn)出67%的雞馬立克氏病特有的死亡和損傷現(xiàn)象,對rMd5的保護指數(shù)僅達到33%;免疫12d后感染rMd5組表現(xiàn)出47%的雞馬立克氏病特有的死亡和損傷現(xiàn)象,GX0101Δmeq-BAC對rMd5的保護指數(shù)可以達到53%。3gx0101meq-bac作為疫苗的免疫效力與其它皰疹病毒一樣,MDV的基因組DNA具有感染性Tischer與Petherbridge的研究同時發(fā)現(xiàn),基于BAC的感染性質(zhì)粒免疫雞后只能通過在體內(nèi)拯救出感染性病毒才能發(fā)揮作用,而不具備拯救性的克隆質(zhì)粒不具有免疫效力,其過程為免疫的感染性質(zhì)粒在體內(nèi)拯救出病毒,實質(zhì)還是以活病毒的形式起到免疫效果,因此,感染性質(zhì)粒含有何種類型的MDV基因組拯救的病毒將會對其免疫效力產(chǎn)生重大影響,到目前為止,除了近幾年報道的基因缺失苗外,還沒有發(fā)現(xiàn)比CVI988/Rispens更好的疫苗考慮到MDV在自然環(huán)境中感染雞的時間可能會比較早,為了更好的考察GX0101Δmeq-BAC作為疫苗的保護效果,我們設(shè)置了兩個GX0101ΔmeqBAC免疫組,分別在免疫后的5d與12d進行攻毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn),GX0101Δmeq-BAC免疫后5d時攻毒與12d攻毒相比,保護效果比較差,部分原因可能是在5日齡時小雞更加易感的緣故,另外,GX0101Δmeq-BAC在體內(nèi)由感染性克隆DNA到拯救足夠的活病毒并發(fā)揮免疫效果需要一定的時間也是重要的原因,這說明,與CVI988/Rispens相比,GX0101Δmeq-BAC作為疫苗會有一定的免疫空當期。本次研究發(fā)現(xiàn),GX0101Δmeq-BAC的保護效果并沒有超過細胞結(jié)合型MDV疫苗CVI988/Rispens,一部分原因與其在雞的體內(nèi)拯救活病毒需要一定的時間有關(guān),另一部分原因,DNA疫苗免疫效力的發(fā)揮與機體細胞攝入DNA的量有很大關(guān)系,因此將來有必要在DAN疫苗的免疫劑量及免疫途徑上進行進一步的改進與優(yōu)化。雖然在實驗條件下,以GX0101Δmeq-BAC作為DNA疫苗的保護效果還不是很理想,但考慮到自然感染的劑量沒有實驗室攻毒這么高,發(fā)作時間可能也沒有實驗室攻毒這么直接快速,因此在實際自然感染情況下,DAN疫苗可能會有更好的保護表現(xiàn),但這種推斷需要