斑馬魚的性腺發(fā)育

斑馬魚的性腺發(fā)育斑馬魚的性腺發(fā)育第1頁精巢組織學結構和不一樣發(fā)育階段生殖細胞形態(tài)精巢一對，位于腹腔背部兩側(cè)，體積較小，以系膜與體壁相聯(lián)，左右精巢彼此分開，在尾端合并成一條很短輸精管，和普通鯉科魚類相同。生殖上皮伴隨結締組織向精巢內(nèi)部延伸，形成許多隔膜，把精巢分成許多不規(guī)則精小葉，從其橫切面上可見許多精小葉緊密排列，但沒有一定規(guī)律性，精小葉為精巢實質(zhì)個別，因其呈管狀又可稱為精小管。在精小葉內(nèi)由許多精小囊組成，伴隨精巢發(fā)育，精小葉內(nèi)各精小囊間生精細胞發(fā)育不一樣時，而在同一精小囊內(nèi)生精細胞發(fā)育是同時。精小葉中央為小葉腔，小葉腔在精巢內(nèi)相互連接成網(wǎng)狀，最終通到輸精管，精原細胞位于精小葉邊緣處，在分化過程中，當生殖細胞在精小囊內(nèi)發(fā)育成為成熟精子時，精小囊破裂，成熟精子釋放到小葉腔中，各小葉腔內(nèi)精子最終聚集到輸精管內(nèi)并可借助于輸精管排出，所以成熟精子只在小葉腔和輸精管內(nèi)存在。生殖細胞在發(fā)生上由外向里可分為精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子。斑馬魚的性腺發(fā)育第2頁繁殖期，V期精巢斑馬魚的性腺發(fā)育第3頁III期精巢；小葉腔顯著，初級精母細胞排列多層，百分比尺示24μmSg，精原細胞；ScⅠ，初級精母細胞；ScⅡ，次級精母細胞；St，精子細胞；Sz，精子；LL，小葉腔；LC，間質(zhì)細胞；SC，支持細胞；ST，精小囊斑馬魚的性腺發(fā)育第4頁VI期晚期精巢，示精小囊內(nèi)發(fā)育同時各期生殖細胞，百分比尺示24μmSg，精原細胞；ScⅠ，初級精母細胞；ScⅡ，次級精母細胞；St，精子細胞；Sz，精子；LL，小葉腔；LC，間質(zhì)細胞；SC，支持細胞；ST，精小囊斑馬魚的性腺發(fā)育第5頁V期早期精巢，示精原細胞，精母細胞，精子細胞和精子，百分比尺示24μmSg，精原細胞；ScⅠ，初級精母細胞；ScⅡ，次級精母細胞；St，精子細胞；Sz，精子；LL，小葉腔；LC，間質(zhì)細胞；SC，支持細胞；ST，精小囊斑馬魚的性腺發(fā)育第6頁V期中期精巢，示成熟精子充滿整個精小葉，百分比尺示24μm；Sg，精原細胞；ScⅠ，初級精母細胞；ScⅡ，次級精母細胞；St，精子細胞；Sz，精子；LL，小葉腔；LC，間質(zhì)細胞；SC，支持細胞；ST，精小囊斑馬魚的性腺發(fā)育第7頁Ⅵ期精巢，示精子排出后留下空腔，腔內(nèi)有少許殘余精子和第二次發(fā)育由精原細胞有絲分裂產(chǎn)生初級精母細胞.Sg，精原細胞；ScⅠ，初級精母細胞；ScⅡ，次級精母細胞；St，精子細胞；Sz，精子；LL，小葉腔；LC，間質(zhì)細胞；SC，支持細胞；ST，精小囊斑馬魚的性腺發(fā)育第8頁卵巢組織學結構和不一樣發(fā)育階段生殖細胞形態(tài)斑馬魚卵巢一對，左右兩葉，大個別對稱；成熟卵巢呈囊狀，位于體腔內(nèi)，外被由平滑肌和結締組織形成卵巢膜，卵巢膜不發(fā)達。卵巢位于腹中線兩側(cè)，在魚體后端匯合成一短輸卵管，進入泄殖腔，由泄殖腔開口于體外。卵母細胞直徑、核徑和核質(zhì)比在不一樣時相中改變:

卵母細胞在Ⅱ時相增加不顯著，在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ時相期增加快速胞核直徑在Ⅱ時相增加快速，在Ⅲ時相中期、Ⅳ時相增加遲緩，幾乎沒有改變核質(zhì)比在第Ⅱ時相最大，伴隨卵母細胞發(fā)育，核質(zhì)比越來越小斑馬魚的性腺發(fā)育第9頁卵巢壁:由兩層被膜組成，外層為腹膜，內(nèi)層為白膜。白膜由外到內(nèi)依次為扁平上皮細胞、疏松結締組織、間質(zhì)組織和生殖上皮。產(chǎn)卵板:白膜中結締組織向卵巢內(nèi)部伸展與卵巢生殖上皮共同組成板層狀結構，稱產(chǎn)卵板，是卵子產(chǎn)生地方。卵巢腔:存在于卵巢內(nèi)部空腔，與輸卵管相通。SB產(chǎn)卵板斑馬魚的性腺發(fā)育第10頁不一樣齡雌魚卵巢發(fā)育0～16日齡:沒有觀察到性腺發(fā)育情況。17～22日齡:原始生殖細胞沒有兩性分化，數(shù)量開始增多，并逐步聚集成團，細胞質(zhì)嗜酸性，核較大，嗜堿性，有一顯著核仁。27日齡:原始生殖細胞分化為卵原細胞，體積變大，數(shù)量增多，成排排列，在腹腔后背個別布，與肝胰臟相連。32～57日齡:卵巢體積較小，位于腹腔后背部，靠近肝胰臟。卵巢內(nèi)主要為第Ⅰ時相卵母細胞，細胞體積小，圓形，細胞質(zhì)少，有一顯著細胞核。核中部有1～2個核仁，核內(nèi)染色質(zhì)細絲狀。62日齡:主要為第Ⅱ時相卵母細胞，細胞為多角形、圓形。細胞質(zhì)較多，染色較深，為淡紫紅色。核對應增大，弱嗜酸性，核仁數(shù)個，靠近核膜內(nèi)側(cè)分布。卵母細胞外面有一層濾泡細胞。67～72日齡:卵巢粗短，主要存在第Ⅱ時相和發(fā)育早期第Ⅲ時相卵母細胞。早期第Ⅲ時相卵母細胞比第Ⅱ時相卵母細胞體積大，圓形或橢圓形，染色較淺，核周細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少許空泡。細胞核較大，弱嗜酸性，核仁多個，分布在核膜內(nèi)緣，被染成深藍色。卵母細胞外周輻射帶很薄，結構不顯著，細胞外隱約能看到兩層濾泡膜。斑馬魚的性腺發(fā)育第11頁77日齡:以第Ⅱ、Ⅲ時相卵母細胞為主，大個別第Ⅲ時相卵母細胞處于發(fā)育中期。中期第Ⅲ時相卵母細胞近圓形，體積顯著增大。胞質(zhì)空泡內(nèi)出現(xiàn)了嗜酸性卵黃顆粒，越靠近細胞核，卵黃顆粒越大。卵核體積增大，染色較淺，核仁多個，分布在核膜內(nèi)緣。隨卵母細胞發(fā)育，核仁逐步向核中央移動，呈深藍色。細胞周圍輻射帶顯著，并伴隨細胞體積增大而增厚，細胞外兩層濾泡膜發(fā)育顯著。82～90日齡:以第Ⅲ、第Ⅳ時相卵母細胞為主。晚期第Ⅲ時相卵母細胞體積較大，空泡內(nèi)充滿卵黃。第Ⅳ時相卵母細胞因為卵黃物質(zhì)不停積累，細胞體積繼續(xù)增大，圓球形卵黃顆?；A充滿卵母細胞質(zhì)。細胞核逐步由中央向動物極移動。卵巢壁隨卵母細胞數(shù)量增多和體積增加而逐步變薄，放射帶顯著增厚。成熟小魚:卵巢白膜變得很薄。卵巢以第Ⅴ時相卵母細胞為主，也存在有發(fā)育早期卵母細胞。第Ⅴ時相卵母細胞已充分發(fā)育，呈圓球形，卵黃顆粒相互融合，細胞質(zhì)中充滿粗大卵黃顆粒，散布于整個卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)。至此，卵母細胞發(fā)育成熟，很快，核膜崩解、消失，卵母細胞進入第2次成熟分裂中期，形成次級卵母細胞，排到卵巢腔。產(chǎn)卵后小魚:卵巢細長，結構渙散，包含有排卵后空濾泡、第Ⅱ時相、第Ⅲ時相和第Ⅳ時相卵母細胞。斑馬魚的性腺發(fā)育第12頁繁殖期，IV期卵巢斑馬魚的性腺發(fā)育第13頁Ⅰ期：初級生長久(primarygrowthstage)，卵母細胞(卵泡)體積小(7~140μm)，卵母細胞開始生長。Ⅱ期：皮質(zhì)泡時期(corticalalveolusstage)，卵泡直徑140~340μm。卵母細胞體積深入增大，卵母細胞外周皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)許多小泡。Ⅲ期：卵黃增生期(vitellogenesisstage)，卵泡直徑340~690μm。卵母細胞體積增加很快，卵黃顆粒物質(zhì)快速積累，越靠近細胞核，卵黃顆粒越大。Ⅳ期：卵母細胞成熟期(oocytematurationstage)，卵泡直徑690~730μm。因為卵黃顆粒數(shù)量和體積增加，圓球形卵黃顆?；A充滿卵母細胞細胞質(zhì)。Ⅴ期：成熟卵期(matureeggstage)，卵泡直徑730~750μm。卵母細胞成熟，細胞內(nèi)充滿了粗大卵黃顆粒。斑馬魚的性腺發(fā)育第14頁1Ⅱ時相卵母細胞(皮層濾泡期或卵黃生成前期)

主要是處于小生長久卵母細胞。卵母細胞直徑在約為54.56～94.24μm，核徑約為29.76～59.52μm，核質(zhì)比約為：0.11～0.42。核形不規(guī)則，呈圓形、橢圓形或多角形，細胞質(zhì)嗜堿性，H.E染色呈深紫色，核淺藍色，位于細胞中央。在同一切面上核內(nèi)有3-10個核仁，沿核膜內(nèi)緣分布。依據(jù)卵徑大小和結構形態(tài)不一樣，這個時相又能夠分為三個階段；在早期，卵母細胞形態(tài)依然不規(guī)則，形狀多變；在發(fā)育中期，卵母細胞呈近圓球形；發(fā)育晚期，卵母細胞內(nèi)生長環(huán)快速擴充。濾泡膜僅一層。斑馬魚的性腺發(fā)育第15頁Ⅲ時相卵母細胞(卵黃生成期)主要是處于大生長久早期初級卵母細胞。第3時相卵母細胞比第2時相卵母細胞大，但染色要淺。卵母細胞呈圓球形，該時相卵母細胞開始出現(xiàn)液泡，內(nèi)含物被H.E染成淡紅色。濾泡膜上皮細胞開始分裂，并與卵母細胞質(zhì)膜分離，出現(xiàn)不顯著放射帶。依據(jù)卵母細胞大小、卵黃沉積多少以及放射膜有沒有將其分為早、中、晚三個時期。斑馬魚的性腺發(fā)育第16頁Ⅲ時相早期卵母細胞直徑在約為97.3～155.68μm之間，核徑約為38.92～68.11μm，核質(zhì)比約為：0.02～0.14。胞質(zhì)弱嗜堿性。核質(zhì)嗜酸性，核仁位于核膜內(nèi)緣，主要為小核仁，35個左右。細胞質(zhì)外緣出現(xiàn)少許小液泡，直徑1～2μm，較透明，內(nèi)含物極少。卵母細胞外周放射帶很薄，結構不顯著。此時已經(jīng)形成兩層膜結構。斑馬魚的性腺發(fā)育第17頁Ⅲ時相中期卵母細胞顯著增大，卵母細胞直徑在約為124～198.4μm，胞核約49.6～119.04μm，核質(zhì)比為0.03～0.36。核質(zhì)被染成淺紫色，大核仁少見，小核仁約40個左右，其中較大分布于核膜內(nèi)側(cè)，較小散在于核質(zhì)中。放射帶發(fā)育顯著。內(nèi)層膜細胞呈立方形，而外層仍為扁平形。斑馬魚的性腺發(fā)育第18頁Ⅲ時相晚期卵母細胞增大為145.95～330.82μm，核徑為48.65～58.38μm，核質(zhì)比0.006～0.06。液泡充滿卵黃，放射帶外周形成均染粉紅色膠質(zhì)膜結構，小核仁45個左右，多位于核膜內(nèi)側(cè)周圍。斑馬魚的性腺發(fā)育第19頁IV時相卵母細胞(卵母細胞成熟期)主要是處于大生長久晚期初級卵母細胞。因為卵黃物質(zhì)不停積累，卵母細胞細胞體積繼續(xù)增大、卵黃快速積累、液泡被積壓到卵母細胞周圍細胞質(zhì)中，圓球形卵黃顆?；A充滿卵母細胞質(zhì)，卵母細胞直徑在約為379.47～447.58μm，胞核約38.92～68.11μm，核質(zhì)比為0.0007～0.004，細胞質(zhì)及細胞核開始由中央直接移向動物極移動，卵母細胞開始表現(xiàn)出極性。放射帶顯著增厚。斑馬魚的性腺發(fā)育第20頁V時相卵母細胞(成熟卵期)卵母細胞已充分發(fā)育，呈圓球形，卵徑約為467.04～564.34μm。卵黃顆粒相互融合，細胞質(zhì)中充滿粗大卵黃顆粒，卵黃顆粒散布于整個卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)，至此，卵母細胞已經(jīng)成熟，以后便脫離濾泡膜而排入卵巢腔。斑馬魚的性腺發(fā)育第21頁2.2.2.5VI時相卵母細胞卵細胞排出，剩下空濾泡膜，形狀不規(guī)則，蜷曲于卵巢內(nèi)。斑馬魚的性腺發(fā)育第22頁斑馬魚繁殖斑馬魚的性腺發(fā)育第23頁斑馬魚為研究脊椎動物胚胎發(fā)育理想模式生物子代數(shù)多能夠光周期誘發(fā)產(chǎn)卵體外受精，胚體透明，胚胎發(fā)育快能夠誘發(fā)產(chǎn)生突變種能夠分子生物技術控制特定基因表現(xiàn)或產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)殖魚在胚胎發(fā)育時期訊號傳遞路徑和哺乳動物有很高同源性斑馬魚的性腺發(fā)育第24頁分辨斑馬魚雌雄

公魚：與性成熟前體態(tài)相同，保持原本流線型，臀鰭較母魚長。在身上各個魚鰭末端，時常可看到有顯著黃色出現(xiàn)。母魚：性成熟后肚子開始膨大，里面卵囊形成卵，臀鰭較公魚來得小、短且較圓，魚鰭末端有時也有黃色出現(xiàn)，但相對于公魚出現(xiàn)時間比較少。斑馬魚的性腺發(fā)育第25頁斑馬魚的性腺發(fā)育第26頁步驟一、布置環(huán)境※光周期調(diào)控：斑馬魚需要在約14:10光照周期下，才會產(chǎn)生交配產(chǎn)卵行為?！疁兀盒柙?4~28.5℃。在適當水溫下，將公魚和母魚分缸進行喂養(yǎng)約5-7天后，即可在光周期天亮后1小時內(nèi)，看到斑馬魚進行交配行為。斑馬魚的性腺發(fā)育第27頁步驟二、交配前準備產(chǎn)卵前一天準備：挑選出適當公魚跟母魚，體長要盡可能一樣，母魚能夠略大一些。將公魚與母魚分別放置產(chǎn)卵缸兩側(cè)，中間設置隔板將其隔開。產(chǎn)卵房準備斑馬魚的性腺發(fā)育第28頁放入隔板及斑馬魚上盒與普通下盒組裝上盒底以網(wǎng)狀材料代替產(chǎn)卵房準備防止剛產(chǎn)出魚卵被成魚吃掉，而有特殊設計！1234斑馬魚的性腺發(fā)育第29頁步驟三、交配當日光周期控制隔天清晨，當日亮后約十分鐘，公魚和母魚會恢復清醒。當母魚發(fā)覺公魚時，因為前一天費洛蒙影響，母魚在天亮后也釋放另一個費洛蒙，使公魚往母魚方向前往行為愈加顯著及強烈。此時就能夠準備打開隔板，讓公魚跟母魚進行交配。斑馬魚的性腺發(fā)育第30頁交配中公魚在交配過程中，采絕對主動方式，會先以眼睛觀察并決定要向哪一只母魚進行攻勢。其次會進行求偶舞蹈，在想要交配母魚周圍繞圈圈或是８字型，游向母魚后，利用腹部側(cè)面摩擦母魚，刺激母魚排卵，公魚便會同時射精。斑馬魚的性腺發(fā)育第31頁產(chǎn)卵母魚會一次把全部腹中卵包含卵囊全部排出，一胎聚會生出200-500顆卵。排出后母魚會重新產(chǎn)生新卵，約3-5天就能夠再生下一次卵。伴伴隨卵釋放，會有其它激素一起排出，這種激素能夠讓母魚順利把卵排放出來，另外一個功效則是讓其它還產(chǎn)生卵母魚，停頓排卵行為，這在演化上算是一個競爭結果。斑馬魚的性腺發(fā)育第32頁注意事項（1）母魚體內(nèi)卵，假如太長時間沒有交配，或是沒有完全排完，卵會留在體內(nèi)，并不會重新被吸收回去，假如超出太久沒有排卵，母魚腹部中卵會死亡，而且造成母魚腹部類似囊腫殘留物，這種囊腫會讓母魚下次排卵不順，甚至無法排卵而被公魚激烈追求之后而難產(chǎn)死亡，當前也沒有很好方式改進這種情況。普通認為，固定一段時間就讓公魚跟母魚進行交配，讓母魚把卵排出，是很好方式。斑馬魚的性腺發(fā)育第33頁注意事項（2）斑馬魚卵在受精后，約72小時即可孵化，在這段期間內(nèi)，不需要給予打氣，只要放在潔凈水中即可孵化。放在解剖顯微鏡下，即可清楚看到斑馬魚胚胎發(fā)育整個經(jīng)過。斑馬魚的性腺發(fā)育第34頁人工受精將魚放入冰水中，直至不太活動為止。統(tǒng)計魚體長、體重雌魚：輕壓腹部，卵子流出。搜集到小培養(yǎng)皿中。雄魚：同雌魚。加1mlD-hanks液稀釋。將稀釋精子加入卵子中。斑馬魚的性腺發(fā)育第35頁斑馬魚卵巢取得發(fā)育成熟且腹部膨大雌性斑馬魚體表用75％酒精消毒，用眼科剪小心剪開腹部后，快速用眼科鑷取白色半透明兩側(cè)卵巢置于已除菌清洗液D-Hank溶液中斑馬魚的性腺發(fā)育第36頁卵細胞分離用D-Hank’s溶液洗去卵巢周圍附帶脂肪、結締組織及血塊等雜質(zhì)。將個別卵巢置于一裝有新鮮D-Hank’s溶液培養(yǎng)皿中，用眼科鑷小心撕開卵巢外膜并輕輕抖動，同時用另一眼科鑷將卵細胞從結締組織中剝離。此種卵母細胞外被濾泡膜。當卵細胞基礎從卵巢中分散出來后，選出濾泡膜完整卵母細胞，用移液管輕輕吹打卵細胞5-10次至卵細胞單個分離。用D-Hank’S溶液洗滌分離好卵細胞2-3次。斑馬魚的性腺發(fā)育第37頁卵細胞培養(yǎng)取20-30個卵細胞于直徑35mm無菌培養(yǎng)皿中，加人3ml培養(yǎng)液，封口，于培養(yǎng)箱內(nèi)27℃、飽和濕度條件下成熟培養(yǎng)18h。卵細胞直徑0.65mm或以上培養(yǎng)液為

90%LeibovitzL-15，pH9培養(yǎng)液中添加定量FSH（0、0.1、0.5、1、2、5μg/ml）斑馬魚的性腺發(fā)育第38頁成熟判定卵母細胞成熟是一個包含細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜、透明帶等多方面在內(nèi)復雜生物學過程。在形態(tài)上表現(xiàn)為生發(fā)泡破裂，核仁消失，紡錘體形成，染色質(zhì)濃縮為染色體，第一極體排出，卵丘、顆粒細胞擴散、膨脹和透明帶軟化等。本試驗以生發(fā)泡破裂即細胞核消失判定卵細胞成熟。在添加TB（終濃度0.2%）培養(yǎng)液中25度10分鐘染色后觀察。將培養(yǎng)后卵細胞置于透明液(clearingsolution)中固定，在倒置顯微鏡下觀察。無細胞核卵細胞既是已發(fā)生生發(fā)泡破裂(GVBD)成熟卵細胞。斑馬魚的性腺發(fā)育第39頁卵母細胞完整性觀察

解剖鏡下對用兩種方法取得斑馬魚卵母細胞進行形態(tài)學觀察斑馬魚的性腺發(fā)育第40頁細胞存活率測定取同一條魚兩側(cè)卵巢，解剖鏡下，對培養(yǎng)前和18小時培養(yǎng)后成活卵細胞進行計數(shù)，以其與培養(yǎng)細胞總數(shù)之比作為存活率。斑馬魚的性腺發(fā)育第41頁細胞成熟率測定取同一條魚兩側(cè)卵巢，隨機選出5個細胞用固定液固定，解剖鏡下檢測，若成熟細胞≤1個，即所獲卵母細胞處于第Ⅳ期，則將分離得到此批卵細胞分裝培養(yǎng)。18小時后，將卵母細胞固定后在解剖鏡下觀察，依據(jù)細胞核有沒有計數(shù)成熟卵母細胞個數(shù)，以其與卵母細胞總數(shù)之比作為成熟率(GVBD％)。斑馬魚的性腺發(fā)育第42頁斑馬魚的性腺發(fā)育第43頁細胞生長曲線繪制將分離得到卵母細胞培養(yǎng)于無菌培養(yǎng)ⅢL中，從0d時起，每隔兩小時從培養(yǎng)皿中取一定數(shù)目標卵母細胞，用固定液固定后，解剖鏡下檢測，依據(jù)細胞核有沒有判斷卵母細胞成熟，分別計數(shù)細胞總數(shù)和成熟卵母細胞數(shù)。以培養(yǎng)時間為橫坐標，卵母細胞成熟率(GVBD％)為縱坐標，繪制生長曲線。斑馬魚的性腺發(fā)育第44頁成熟卵受精卵母細胞在發(fā)生GVBD后每隔0.5h取數(shù)粒卵子，置Hanks液內(nèi)，用兩把尖鑷小心剝?nèi)V泡膜，并移入冷開水中，取精子加到卵子旁使二者混合，此時作為受精開始時間。3mim后將卵取出放在Holtfreter液中，于25℃繼續(xù)培養(yǎng)。定時觀察受精卵發(fā)育并作攝影統(tǒng)計。以發(fā)育到囊胚為受精標志，統(tǒng)計受精率。斑馬魚的性腺發(fā)育第45頁斑馬魚的性腺發(fā)育第46頁Holt緩沖液NaCl 3.5g/LKCl 0.05g/LCaCl2 0.1g/LNaHCO3 0.025g/L斑馬魚的性腺發(fā)育第47頁清洗液D-Hank溶液(加入100unit/mL青霉素和鏈霉素)培養(yǎng)液:90%LeibovitzL-15(加入100unit/mL青霉素和鏈霉素)透明液(clearingsolution):酒精(6):乙酸(1):多聚甲醛（3）斑馬魚的性腺發(fā)育第48頁Leibovitz'sMediumspecificallydesignedtogrowcellsinaCO2freeatmosphere.Thestandardsodiumbicarbonate/CO2bufferingsystemisreplacedbycombinationoffreebasicaminoacids,phosphatebuffersandhigherlevelsofgalactoseandsodiumpyruvate.Asaresult,themediumdoesnotrequiresupplementationwithsodiumbicarbonateandcanbeusedunderconditionsoffreegaseousexchangewiththeatmosphere.ThemediumcanbeusedtogrowhumantumorcellsandembryoniccellsandalsoestablishedcelllineslikeHeLaandHep-2.