高分辨率熔解曲線

一種基因分析新技術(shù)高分辨率熔解曲線01HRM介紹技術(shù)特點(diǎn)應(yīng)用基本原理常用儀器技術(shù)展望目錄0305020406基本信息高分辨率熔解曲線(high-resolutionmelting，HRM)是一種基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同形態(tài)熔解曲線的基因分析新技術(shù)，具有極高的敏感性，可以檢測出單個(gè)堿基的差異，并且成本低、通量高、速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、不受檢測位點(diǎn)的局限，實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。在突變掃描、單核苷酸多態(tài)性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面HRM分析技術(shù)發(fā)揮著重要作用。HRM介紹HRM介紹高分辨率熔解曲線分析（highresolutionmeltinganalysis，HRM）是國際上發(fā)展的一種新型的檢測單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）及掃描突變的新技術(shù)。HRM無需使用序列特異性探針，而是利用一種飽和染料對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析?；驹砘驹鞨RM的基本原理：雙鏈核苷酸（doublestrandDNA，dsDNA）的熱穩(wěn)定性受其長度和堿基組成的影響，序列變化會(huì)導(dǎo)致升溫過程中dsDNA解鏈行為的改變。因?yàn)樗玫臒晒馊玖现荒芮度氩⒔Y(jié)合到dsDNA上，因此利用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，通過實(shí)時(shí)檢測dsDNA熔解過程中熒光信號值的變化，就能以生成不同形狀熔解曲線的方式將PCR產(chǎn)物中存在的差異直觀地展示出來。同時(shí)，借助于專業(yè)性的分析軟件就可以對測試群體實(shí)現(xiàn)基于不同形狀熔解曲線的基因分型或歸類。

技術(shù)特點(diǎn)技術(shù)特點(diǎn)相對于其它基于PCR的DNA多態(tài)性檢測技術(shù)如單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrandconformationpolymorphism，SSCP）、變性高效液相色譜（denaturinghigh-performanceliquidchromatography，dHPLC）、變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）等，HRM的優(yōu)勢在于操作簡單，分析時(shí)間短，靈敏度和特異性高，PCR產(chǎn)物無需后處理（如酶切、電泳等），可實(shí)現(xiàn)真正的閉管操作從而降低污染風(fēng)險(xiǎn)。另外HRM具有高通量的特點(diǎn)，非常適合大量樣品的分析。因此HRM檢測方法備受，并已發(fā)展成為SNP基因分型、點(diǎn)突變篩查等的重要手段。常用儀器常用儀器常應(yīng)用于HRM檢測的儀器主要有以下幾種：（1）HR-1是美國Idaho公司生產(chǎn)的第一種專門應(yīng)用于HRM的檢測儀，主要用于基因預(yù)編篩查和SNP分析分型。（2）LightScanner，該儀器熒光采集迅速，溫度控制和數(shù)據(jù)獲取優(yōu)勢明顯，因此適用于疾病篩查及測序前的大規(guī)模突變篩查和基因分型。(3)LightScanner32是LightcyclerPCR儀的功能增強(qiáng)版，其溫度控制及熒光檢測的均一性好，可顯著降低實(shí)驗(yàn)誤差。（4）Lightcycler480是瑞士Roche公司生產(chǎn)的具有HRM分析功能的板式全自動(dòng)熒光定量PCR儀，可以做多重PCR檢測分析及多種探針研究模式分析。（5）Rotor-gene6000是全球第一款成功將qPCR擴(kuò)增與HRM結(jié)合在一起實(shí)現(xiàn)閉管操作的儀器。

應(yīng)用SNP分析突變掃描甲基化研究基因分型應(yīng)用序列匹配對凝膠電泳的替代定量研究應(yīng)用SNP分析不同個(gè)體同一條染色體上同一位點(diǎn)的核苷酸序列絕大多數(shù)是一致的，當(dāng)單個(gè)核苷酸堿基不同而導(dǎo)致核酸序列呈包括置換、缺失和插入等多態(tài)性時(shí)，稱單核苷酸多態(tài)性，即SNP。SNP現(xiàn)象在生物體內(nèi)廣泛存在，它是生物遺傳變異的表現(xiàn)之一，因而SNP對研究人類遺傳和進(jìn)化具有重要意義。突變掃描運(yùn)用HRM技術(shù)可以進(jìn)行樣本中已知突變位點(diǎn)的檢測、未知新突變位點(diǎn)的鑒定，已知多態(tài)位點(diǎn)(如SNPs、短串聯(lián)重復(fù)序列、微衛(wèi)星、條形碼序列等)的檢測等。HRM技術(shù)已經(jīng)在人類和動(dòng)植物遺傳疾病的分子診斷、動(dòng)植物各類多態(tài)位點(diǎn)的鑒定與檢測、動(dòng)物生產(chǎn)繁殖數(shù)量性狀位點(diǎn)的鑒定與檢測等研究領(lǐng)域獲得了應(yīng)用，并取得了很多新的研究進(jìn)展。甲基化研究DNA甲基化是發(fā)生在DNA堿基序列上的一種共價(jià)修飾。靶序列上甲基基團(tuán)的存在可以影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，引起轉(zhuǎn)錄抑制，從而使該基因的表達(dá)受到抑制。DNA甲基化是表型遺傳修飾的重要組成部分，在細(xì)胞正常功能維持、遺傳印記、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中扮演重要角色。HRM技術(shù)為DNA甲基化狀態(tài)的檢測另辟蹊徑。DNA樣品通過亞硫酸氫鹽的處理，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。這樣，原先未甲基化模板所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物比甲基化模板的Tm要低。HRM還能確定特定樣品中甲基化的比例。將不同比例的甲基化和未甲基化DNA混合，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的熔解曲線與之相比較，從而確定樣品中甲基化的比例?；蚍中虷RM技術(shù)使用了飽和熒光染料和改進(jìn)的熔解及分析系統(tǒng)，可檢測核酸間的微小差異，其最先被應(yīng)用于基因的分型試驗(yàn)。運(yùn)用該技術(shù)進(jìn)行基因分型較傳統(tǒng)的分型方法（凝膠電泳，高效液相色譜等）具有顯著的優(yōu)越性，并取得了很多新的研究進(jìn)展。人β球蛋白的HbC，HbS和HbE3個(gè)基因型在113bp區(qū)域中，運(yùn)用以往的技術(shù)很難將它們區(qū)分開，Herrmann等應(yīng)用HRM技術(shù)將β球蛋白的3個(gè)基因型分別檢測出來。曹春鴿

利用HRM技術(shù)，快速靈敏地對64例隨機(jī)DNA樣本的CYP2C192和CYP2C193兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型，且HRM方法的分型結(jié)果與測序驗(yàn)證結(jié)果完全一致。序列匹配有些研究并不需要完全的基因型，而只需知道DNA序列是否匹配，例如：組織移植、基因型-表型的相關(guān)性和辯證性.在活器官移植中，需要對HLA進(jìn)行基因分型.這個(gè)主要牽涉到HLA-A，B，C和DR等幾個(gè)位點(diǎn).當(dāng)兩個(gè)個(gè)體的熔解曲線完全相同時(shí)就說明HLA基因型完全匹配.通過1∶1混合樣品進(jìn)行熔解曲線分析，如果樣品不是完全匹配的，那么就將形成不同雜合子而改變?nèi)芙馇€，由此可以通過這種方法來驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。

定量研究HRM技術(shù)具有高度的靈敏性，能鑒別熔解曲線的微小變化，因此可以用做定量分析。檢測變異分子所占的比例，通常使用的方法為雙脫氧測序法和（分辨率下限為20%-30%）和焦磷酸測序法（分辨率下限為1%-10%），但這2種方法既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。Aten等（2008）和Bruder等（2008）成功地運(yùn)用HRM技術(shù)進(jìn)行了不同等位基因的定量分析，結(jié)果表明HRM技術(shù)可以達(dá)到12.5%的分辨率。對凝膠電泳的替代PCR反應(yīng)和酶切反應(yīng)結(jié)果的檢驗(yàn)方法是傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳，但這種方法要結(jié)合一些有毒染料（如溴化已錠（EB））進(jìn)行染色，對試驗(yàn)人員的安全產(chǎn)生潛在的威脅。HRM技術(shù)替代瓊脂糖凝膠電泳是一種很好的選擇，通過熔解曲線可以清楚地鑒別反應(yīng)產(chǎn)物的特異性和濃度大小等。其優(yōu)點(diǎn)非常明顯，不必使用凝膠基質(zhì)和有毒染料，后期的數(shù)據(jù)處理也可以通過分析軟件自動(dòng)進(jìn)行，可以加快試驗(yàn)的速度（核酸熔解的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠電泳的速度），且HRM技術(shù)不會(huì)損害所分析的核酸樣品，仍然可以做凝膠瓊脂糖電泳檢測。

技術(shù)展望技術(shù)展望HRM技術(shù)具有高通量、高靈敏度和