擴(kuò)張型心肌病先證者及其家族的全基因組測序研究

擴(kuò)張型心肌病先證者及其家族的全基因組測序研究

擴(kuò)張性心肌?。╟dm）是一種心理疾病。在沒有高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病或瓣膜異常的情況下，它會出現(xiàn)室心擴(kuò)大和收縮功能的降低。1對象和方法兩組患者的年齡、性別、種族分布情況比較入選2017年9月南京市江寧醫(yī)院心內(nèi)科病區(qū)收治的DCM先證者及其家族成員共19例為觀察組，另隨機(jī)選取50名南京市江寧醫(yī)院體檢中心的年齡、性別、種族與上述家系成員相匹配的正常健康志愿者為對照組，將觀察組和對照組的年齡、性別及種族進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，先證者及其家屬簽訂知情同意書。心動(dòng)圖、心臟核磁共振檢查對先證者及其家族成員均進(jìn)行臨床病史、家族史采集，并完善心電圖(electrocardiograph,ECG)、超聲心動(dòng)圖(ultrasoniccardiogram,UCG)、心臟磁共振(cardiacmagneticresonance,CMR)檢查。DCM臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：具有心室擴(kuò)大和心肌收縮功能降低的客觀證據(jù)：①左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)>5.0cm(女性)和LVEDd>5.5cm(男性)(或大于年齡和體表面積預(yù)測值的117%,即預(yù)測值的2倍基因組變異檢測通過先證者遺傳咨詢收集DCM家族中所有直系親屬及對照組全血樣本(5mL,EDTA抗凝)。全血送華大基因臨床檢測中心，提取DNA后進(jìn)行全基因組外顯子二代測序，尋找可能致病基因；全基因組測序結(jié)果進(jìn)行過濾后使用BWA對比軟件與人的參考基因組進(jìn)行對比(GRCh37/HG19)。對比結(jié)果使用Picard軟件去除重復(fù)的reads,隨后用GATK軟件來檢測基因組變異，包括SNP和InDel,并對原始的變異結(jié)果進(jìn)行過濾，得到可信度高的變異結(jié)果。進(jìn)一步使用SnpEff軟件對變異結(jié)果進(jìn)行注釋。根據(jù)生物信息學(xué)軟件預(yù)測的變異風(fēng)險(xiǎn)度，在篩選出的結(jié)果中尋找與心肌病相關(guān)的變異。最終篩選出可能與心肌病相關(guān)的變異位點(diǎn)，用Sanger一代測序法進(jìn)行驗(yàn)證。對一代驗(yàn)證測序的峰圖進(jìn)行分析，SNP位點(diǎn)為純合時(shí)成單峰，若為雜合子時(shí)，會形成套峰現(xiàn)象。本研究使用的TTN轉(zhuǎn)錄本為ENTS00000359218.10。一代驗(yàn)證陽性的結(jié)果考慮為可能的致病基因。并對尚沒有臨床表型的DCM直系家屬進(jìn)行相關(guān)責(zé)任致病基因一代驗(yàn)證以發(fā)現(xiàn)可能攜帶者，描繪家系圖譜。2結(jié)果病因、發(fā)病家族先證者(Ⅲ6):男，38歲，近1周爬2層樓即感心慌胸悶，伴乏力，休息后緩解。否認(rèn)既往高血壓病、冠心病病史。ECG:竇性心律，Ⅱ、Ⅲ、aVF導(dǎo)聯(lián)ST段輕度水平下移。UCG:LVEDd57mm,LVEF40%。CMR:間隔壁心肌中層部分延遲強(qiáng)化。冠狀動(dòng)脈CTA未見冠狀動(dòng)脈血管明顯狹窄。發(fā)病家族成員情況：Ⅰ1和Ⅰ2死亡原因不明，Ⅱ1于58歲死亡，Ⅱ3(先證者父親)和Ⅲ2(先證者堂哥)診斷為DCM,發(fā)病時(shí)均表現(xiàn)為胸悶氣促。Ⅱ3ECG:竇性心律，左前分支阻滯，V個(gè)基因錯(cuò)義突變先證者(Ⅲ6)攜帶TTNc.46467G>T(p.Glu15490Lys)、TTNc.28987G>A(p.Ala9663Ser)、MYH7c.2420G>A(p.Arg807His)3個(gè)基因的錯(cuò)義突變。其中TTN-E220c.46467G>T為新發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)。TTN-102c.28987G>A以及MYH7-E21c.2420G>A兩個(gè)突變位點(diǎn)在gnomAD數(shù)據(jù)庫中均查有記錄，兩個(gè)等位基因頻率分別為5.75×10家系成員Sanger測序結(jié)果2名家系成員(Ⅱ3、Ⅲ2)的Sanger測序檢測到TTN-E220、TTN-E102、MYH7-E21這3個(gè)基因的錯(cuò)義突變位點(diǎn)，與先證者(Ⅲ6)高通量測序結(jié)果一致，詳見圖3。其他未患病家系成員均未檢測到上述3個(gè)突變基因。未發(fā)現(xiàn)在健康對照人群中有上述基因突變。家系成員攜帶基因突變的家系圖譜見圖2。常染色體顯微型該家系中3例明確患有DCM,候選基因外顯子高通量測序及Sanger測序明確3例均存在TTN-E220(p.Glu15490Lys)雜合錯(cuò)義突變、TTN-E102(p.Ala9663Ser)雜合錯(cuò)義突變以及MYH7-E21(p.Arg807His)雜合錯(cuò)義突變。家系中其他未患有DCM的成員均未攜帶DCM致病基因，由此可明確為常染色體顯性遺傳。分析本家系中不同表型與發(fā)病年齡和性別的關(guān)系，可發(fā)現(xiàn)先證者(Ⅲ6)、先證者父親(Ⅱ3)、先證者堂哥(Ⅲ2)目前分別是38歲、65歲和41歲，患病年齡相近，并且都在壯年，平均約48歲。另外，該DCM家系的家族成員根據(jù)心功能差異，癥狀也各有不同，心功能越差，癥狀越嚴(yán)重，反之，癥狀較輕微。如先證者(Ⅲ6)LVEF40%,其臨床癥狀僅表現(xiàn)為心慌胸悶，無明顯氣促，而其他2例LVEF均小于40%,癥狀相對較重，均有氣促癥狀。再者，該家系中的心電圖基礎(chǔ)心律表現(xiàn)為竇性心律，偶有室性期前收縮，未發(fā)現(xiàn)惡性心律失常或持續(xù)性房性心律失常。3全基因組外顯子測序DCM病因有基因和非基因因素，DCM中25%～50%為FDCM患者，基因突變與FDCM發(fā)病機(jī)理、臨床表型及預(yù)后等密切相關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)的與DCM相關(guān)的突變基因中，110個(gè)為核蛋白編碼基因，24個(gè)為線粒體DNA編碼基因TTN位于肌小節(jié)兩端，對維持心肌活動(dòng)時(shí)心肌結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有重要的作用，在TTN基因的變異中，截?cái)嗤蛔?1T11Ntruncatingvariants,rITNtv)是DCM最常見的遺傳原因Walsh等全基因組外顯子測序?qū)DCM患者的研究發(fā)現(xiàn)，除了單基因突變外，還有相當(dāng)一部分患者同時(shí)攜帶雙基因或多基因突變，且這些患者與單基因突變的患者相比，發(fā)病年齡更早，心肌組織學(xué)改變更嚴(yán)重，臨床癥狀及預(yù)后更差一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，該家系中所有患者均同時(shí)攜帶3個(gè)突變基因，而所有健康正常者均未攜帶任何一個(gè)突