微量DNA殘留檢測(cè)技術(shù)

微量DNA殘留檢測(cè)技術(shù)DNA殘留檢測(cè)的原理DNA殘留檢測(cè)技術(shù)由兩部分組成：

1.磁珠法提取微量DNA技術(shù)

2.qPCR檢測(cè)技術(shù)

磁珠法提取微量DNA技術(shù)

理論上，存在生物制品中的DNA屬于微量雜質(zhì)，可能傳遞腫瘤或病毒相關(guān)基因，并導(dǎo)致癌變或其他病理變化。因此，宿主細(xì)胞DNA殘留量的控制是生物制品質(zhì)量控制中非常重要的環(huán)節(jié)。原理：

磁珠法提取DNA:這種磁珠微珠的表面標(biāo)記了一種官能團(tuán)，能同核酸發(fā)生吸附反應(yīng)。磁珠法中的細(xì)胞裂解液是一種蛋白變性劑，可使動(dòng)植物的細(xì)胞裂解，并使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)變性，DNA游離釋放，磁珠可以特異地吸附DNA，通過洗滌，去除DNA以外的蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，再用洗脫液解離吸附在磁珠上的DNA。

磁珠法抽提DNA過程：

樣品消化DNA結(jié)合DNA洗滌DNA洗脫蛋白酶K的作用：使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)降解,使DNA充分游離，促進(jìn)DNA的分離。磁珠法核酸純化技術(shù)采用了納米級(jí)磁珠微珠，這種磁珠微珠的表面標(biāo)記了一種官能團(tuán)，能同核酸發(fā)生吸附反應(yīng)。首先要明白70%乙醇的目的一是去除殘留的有機(jī)溶劑如異丙醇另一方面是去除鹽離子及這個(gè)濃度對(duì)沉淀DNA效果最好。70℃水浴不少于10min提高洗脫效率使其提高回收率DNA殘留提取過程定量PCR技術(shù)原理

實(shí)時(shí)定量PCR是一種快速的高通量的檢測(cè)方法，它是基于PCR擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，產(chǎn)物的增加可以通過熒光信號(hào)指示，通過實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR體系中的熒光信號(hào)，對(duì)樣本中初始模板進(jìn)行定量分析。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

CT值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。為什么要檢測(cè)殘余DNA？絕大部分生物制劑是不經(jīng)過胃腸道直接進(jìn)入體內(nèi)，所以除了生物活性外，監(jiān)管部門對(duì)藥品中雜質(zhì)的限量要求非常嚴(yán)格。其中，宿主細(xì)胞殘留DNA因?yàn)榫哂刑貏e的潛在安全風(fēng)險(xiǎn)，一直是國(guó)內(nèi)外藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)關(guān)注的重點(diǎn)。先要了解它的來(lái)源和潛在危害性。來(lái)源：生物制品中的重組蛋白藥、抗體藥、疫苗等產(chǎn)品是用連續(xù)傳代的動(dòng)物細(xì)胞株(Vero，CHO)表達(dá)生產(chǎn)，則產(chǎn)生的生物制品含有特定的雜質(zhì)，雖然經(jīng)過嚴(yán)格的純化工藝，但產(chǎn)品中仍有可能殘余宿主細(xì)胞的DNA片段。對(duì)人可能產(chǎn)生的危害1.殘留外源DNA可能造成插入突變，導(dǎo)致癌基因失活，癌基因被激活等，最終造成使用者致癌。2.殘余DNA可能帶來(lái)傳染性。生物制品中宿主殘余DNA既是是生產(chǎn)中帶來(lái)的雜質(zhì)，還存在一定安全隱患。因此，WHO和各國(guó)藥物注冊(cè)監(jiān)管機(jī)構(gòu)一般只允許生物制劑中存在100pg/劑量以下的殘留DNA。根據(jù)雜質(zhì)來(lái)源和工藝，特殊情況下最高允許10ng/劑量。我國(guó)生物制品中殘余DNA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)我國(guó)參照WHO、FDA和歐盟的標(biāo)準(zhǔn)，很早以前開始就對(duì)生物制品中殘余DNA的含量進(jìn)行限制。酵母、大腸桿菌表達(dá)的生物制品限定不超過10ng/劑，CHO和vero細(xì)胞表達(dá)的生物制品（EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗）等不超過100或10pg/劑。2015年底USP將只收錄高靈敏度、高特異性的qPCR法作為殘留DNA檢測(cè)的推薦方法。收錄：根據(jù)待測(cè)DNA的物種，合成以下基因序列。E.coli:Forwardprimer5’CCTTACGACCAGGGCTACACA3’Reverseprimer5’CTCGCGAGGTCGCTTCTC3’Probe5’CGTGCTACAATGGCGCATACA3’CHO:Forwardprimer5’CCTGAGTTCAATTCCCAGCAA3’Reverseprimer5’ACATTCTGCTTCCATGTATATCTGCA3’Probe5’TGGCTCACAACCATCCGTTATGAGACCT3’

操作的合格標(biāo)準(zhǔn)

任何可檢出樣品濃度必須落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

靈敏度：標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度（標(biāo)曲最低點(diǎn)）的CT值不大于39

線性：標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)不低于0.98，斜率在-3.1~-3.8之間準(zhǔn)確度：三個(gè)重復(fù)陽(yáng)性對(duì)照樣品均值回收率在50%~150%之間。