馬度米星銨對克氏原螯蝦鰓組織結(jié)構(gòu)和抗氧化系統(tǒng)的影響

馬度米星銨對克氏原螯蝦鰓組織結(jié)構(gòu)和抗氧化系統(tǒng)的影響

劉曉曉、騰培、倪涵、等。馬度米星銨對克氏原刺的毒性[j]。動物和獸醫(yī)，2018，50（5）：46-50。LiuXX,TengP,NiH,etal.Effectofmaduramycinammoniumonthegilltissueofcrayfish[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,2018,50(5):46-50.隨著畜牧業(yè)的高度集約化發(fā)展,抗生素在保障畜牧業(yè)發(fā)展、改善人民生活質(zhì)量方面發(fā)揮著不可替代的作用。然而,隨著抗生素越來越廣泛的使用,其暴露在環(huán)境中的機率也逐漸增大。近年來,抗生素所帶來的環(huán)境污染和生態(tài)毒性引起了國內(nèi)外極大的關(guān)注馬度米星銨又稱馬杜霉素,是從馬杜拉放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的一種新型聚醚類離子載體抗生素。馬度米星銨是目前藥效最強的聚醚類離子載體抗生素,具有抗球蟲譜廣、活性高、價格合適和球蟲不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點,被廣泛添加在動物飼料中克氏原螯蝦俗稱小龍蝦,因其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富等特征,深受消費者的喜愛,是中國目前重要的經(jīng)濟水產(chǎn)養(yǎng)殖對象本研究以克氏原螯蝦為模式動物,在急性毒性試驗的基礎(chǔ)上進行亞慢性毒性試驗,研究不同濃度馬度米星銨對克氏原螯蝦鰓組織結(jié)構(gòu)和抗氧化酶活性的影響,為評價馬度米星銨在環(huán)境中的風(fēng)險提供一定依據(jù)。1材料和方法1.1純度及規(guī)格馬度米星銨,由浙江匯能生物股份有限公司提供,純度91.9%以上,批號:1701004。溶劑為95%的乙醇,國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn),批號:20130207。1.2試驗養(yǎng)殖過程試驗所用克氏原螯蝦由江蘇省淡水研究所提供,體重(23.03±2.12)g,置于含有適量水的聚乙烯塑料箱內(nèi)(60cm×40cm×30cm),馴養(yǎng)1周后用于試驗。每天投喂顆粒飼料2次,按照體重的1%足量投喂。2d換水1次,不間斷供氧。養(yǎng)殖用水為經(jīng)3d曝氣、pH為7.0~7.4的脫氯自來水。養(yǎng)殖期間水溫(20±2)℃,水中溶氧6.0mg·L1.3試驗設(shè)計急性毒性試驗參照魏華等根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果,設(shè)定低、中、高3個劑量組(0.7、3.5和7.0mg·L1.4組織勻漿蛋白測定鰓組織樣品在4℃下解凍,用剪刀剪碎,稱重,放入勻漿管中,以1∶9的重量體積比(W/V),加入預(yù)冷的0.86%生理鹽水,勻漿機勻漿,4℃下2500r/min離心10min后立即取上清液。鰓組織勻漿液蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法,考馬斯亮藍蛋白試劑盒購自南京建成生物工程研究所。鰓組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量(以每毫克蛋白計)的測定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒,按照說明書操作步驟進行。1.5漁船組織疾病的切開術(shù)常規(guī)石蠟切片,固定液固定、常規(guī)梯度酒精脫水、石蠟包埋,制成5~6μm切片,HE染色,顯微鏡下觀察。1.6數(shù)據(jù)分析采用改良寇氏(Karber)法2結(jié)果與分析2.1馬度米星銨對克氏原螯蝦幼蝦感染的影響試驗期間,空白對照組與溶劑對照組克氏原螯蝦活力良好,均未發(fā)生死亡。劑量組克氏原螯蝦在接觸試液初期出現(xiàn)暫時性興奮,表現(xiàn)為異?；钴S,快速游動。隨后2個高劑量組克氏原螯蝦口吐白色黏性分泌物,出現(xiàn)死亡。隨著中毒時間的延長,克氏原螯蝦出現(xiàn)仰頭呼吸、活力下降、側(cè)游、行動遲緩和翻轉(zhuǎn)后無力翻身等中毒癥狀。如表1所示,隨馬度米星銨濃度的增加,克氏原螯蝦死亡率越大;相同濃度條件下,染毒時間越長,克氏原螯蝦死亡率越高。以改良Karber方程對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析,得出96h的LC2.2馬度米星銨對克氏原螯蝦各組織中cat活力的影響克氏原螯蝦暴露在含不同濃度馬度米星銨水體中,鰓組織SOD活性變化如圖1所示,與空白對照組相比,7d時呈劑量依賴性,隨馬度米星銨濃度的增加,SOD活性逐漸下降。低劑量組SOD活力呈時間依賴性,隨時間延長而逐漸降低,28d時酶活力極顯著低于空白對照組(P<0.01);中劑量組14d時SOD活力極顯著降低(P<0.01),28d時活力回升,與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05);馬度米星銨暴露7d后,高劑量組SOD活性呈現(xiàn)極顯著降低(P<0.01),28d時恢復(fù)至略低于空白對照組(P>0.05)。結(jié)果表明,整個暴露過程中,低劑量組鰓組織SOD活性逐漸被抑制,中、高劑量組SOD活性隨時間延長先下降后上升。暴露在不同劑量馬度米星銨中克氏原螯蝦鰓組織CAT活性變化如圖2所示,與空白對照組相比,呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。暴露7d時各劑量組與空白對照組相比酶活力升高,14d時各劑量組與空白對照組相比表現(xiàn)為抑制,但差異均不顯著(P>0.05)。暴露28d時,劑量組表現(xiàn)為明顯抑制,與空白對照組相比,低、中劑量組酶活力極顯著降低(P<0.01),高劑量組顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明,經(jīng)馬度米星銨暴露7d后,各劑量組CAT活力雖然有一定的變化(輕微誘導(dǎo)),但是與對照組相比差異不顯著;暴露28d后CAT活力表現(xiàn)下降,顯著低于對照組的CAT水平,說明在28d后克氏原螯蝦CAT活力受到抑制。不同濃度馬度米星銨對克氏原螯蝦鰓組織MDA含量變化如圖3所示,與空白對照組相比,中、高劑量組暴露7d時MDA含量上升,但差異均不顯著(P>0.05),之后隨時間的延長逐漸被抑制。28d時,與空白對照組相比,中劑量組MDA含量顯著下降(P<0.05),高劑量組極顯著下降(P<0.01)。而28d內(nèi)低劑量組與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明,整個馬度米星銨暴露過程中,低劑量組對克氏原螯蝦鰓組織氧化作用與空白對照組比差異不顯著;中、高劑量組在7d時對克氏原螯蝦鰓組織產(chǎn)生輕微氧化作用,但在較長時間(28d)作用下則減輕了機體的脂質(zhì)過氧化作用。2.3管腔微血管腔結(jié)構(gòu)由圖4A可見,空白對照組鰓葉結(jié)構(gòu)完整,鰓膜平整光滑,有規(guī)則。內(nèi)部呼吸上皮細胞整齊有序的排列在微血管腔外,微血管腔內(nèi)有血細胞。與空白對照組相比,低劑量組(圖4B)少量呼吸上皮細胞從鰓膜上脫落進入微血腔,細胞核濃縮或成碎片化,微血管腔結(jié)構(gòu)不完整;中劑量組(圖4C)大部分呼吸上皮細胞脫落溶解,微血管腔結(jié)構(gòu)幾乎完全消失,局部鰓膜結(jié)構(gòu)模糊;高劑量組(圖4D)呼吸上皮細胞幾乎完全壞死并從鰓膜上脫落,鰓膜結(jié)構(gòu)受損,不光滑,看不到正常的鰓結(jié)構(gòu)。3討論3.1馬度米星銨對克氏原蝦的快速毒性作用根據(jù)魚類急性毒性分級標準,本試驗得到的馬度米星銨對克氏原螯蝦96hLC3.2重度環(huán)境脅迫對生物sod活性的影響在正常生理情況下,機體中的活性氧與抗氧化系統(tǒng)處于一種動態(tài)平衡的狀態(tài)。只有受到脅迫時,機體產(chǎn)生大量活性氧自由基,超出抗氧化系統(tǒng)的清除能力,對機體造成氧化損傷。SOD和CAT是機體抗氧化體統(tǒng)中的關(guān)鍵酶,能夠減輕O研究表明,當(dāng)生物體受到輕度逆境脅迫時,SOD活性往往升高;而當(dāng)受到重度環(huán)境脅迫時,SOD活性通常降低,使生物體內(nèi)積累過量的活性氧,從而導(dǎo)致生物體的損傷。本試驗結(jié)果顯示鰓組織SOD活性隨藥物劑量的增加而逐漸被抑制,表明馬度米星銨的暴露濃度已經(jīng)超出克氏原螯蝦機體所能承受的范圍,造成了機體的氧化損傷,與王瑞龍等本試驗MDA含量低劑量組與空白對照組相比沒有顯著差異,中、高劑量組7d時MDA含量有所上升后逐漸下降,暴露28d后MDA含量顯著低于空白對照組。表明暴露7d時鰓組織可能處于脂質(zhì)過氧化狀態(tài),隨暴露時間的延長(14d),逐漸被機體抗氧化系統(tǒng)清除,減輕了機體的脂質(zhì)過氧化作用。此外根據(jù)研究表明3.3低劑量依賴試驗本研究結(jié)果顯示,脅迫28d后,鰓組織損傷程度呈現(xiàn)藥物劑量依賴性,即藥物濃度越高,損傷越嚴重。低劑量組便能觀察到明顯的病理變化;中劑量組可見微血管腔結(jié)構(gòu)已經(jīng)完全消失,大部分呼吸上皮細胞脫落、壞死;高劑量組呼吸上皮細胞幾乎完全脫