53血紅蛋白的提取和分離課件

課題3血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)

－－蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、對其他分子的親和力等千差萬別。分離方法凝膠色譜法

凝膠電泳法

一、基礎(chǔ)知識:一、基礎(chǔ)知識：（一）

凝膠色譜法（分配色譜法）：1、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖）

2、概念：根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的方法3、原理：當不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對（）的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程（），移動速度（），而（）的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（）移動，路程（），移動速度（），相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。相對分子質(zhì)量較小較長較慢相對分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快大分子通過凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；小分子穿過凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢。4、分離過程

混合物上柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收集大分子收集小分子

洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。

由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等緩沖溶液－－洗脫劑組成：配制：作用：調(diào)節(jié)緩沖劑的比例，配制不同pH的緩沖液。抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。（二）、緩沖溶液2．凝膠電泳法：（1）原理：待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。

(三)電泳1.電泳的概念指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程.在凝膠中加入SDS，形成“蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物”，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間的電荷差別，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。（2）分離方法：（3）分離過程：

瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。電泳檢測結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳樣品處理粗分離純化純度鑒定

血液組成成分

1.洗滌紅細胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白二、實驗操作血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細胞中________細胞數(shù)量最多，紅細胞的含量最高的有機化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的___________基團。血漿血細胞紅細胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素返回1.洗滌紅細胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌過程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細胞血漿吸出血漿紅細胞5倍體積生理鹽水攪拌10min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色去除雜蛋白采集得到豬血初次離心后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果返回2.釋放血紅蛋白①蒸餾水的作用是________________________。②加入甲苯的作用是______________________。③充分攪拌的目的是______________________。使紅細胞大量吸水脹裂溶解紅細胞的細胞膜加速紅細胞的破裂

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。磁力攪拌器返回3.分離血紅蛋白分離過程紅細胞混合液高速離心10min離心管濾紙過濾脂溶物質(zhì)燒杯分離血紅蛋白溶液有機溶劑（無色透明的甲苯層）脂類物質(zhì)（白色脂溶性物質(zhì)沉淀層）血紅蛋白溶液（紅色透明液體）紅細胞破碎物沉淀（暗紅色沉淀物）4.透析血紅蛋白20mmol/L磷酸緩沖液1mL1mL利用透析袋透析透析過程返回純化－－凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：3.樣品的加入和洗脫（二）凝膠色譜操作

（1）凝膠色譜柱的制作材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液裝填:2.凝膠色譜柱的裝填：步驟操作要求①②③④⑤立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴

凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計算稱量凝膠固定色譜柱（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。②凝膠的前處理：配制凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。

2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。注意：1、洗脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。裝配好的凝膠柱3.樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。3.樣品的加入和洗脫3.樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。收集得到的純化后的血紅蛋白課題3血紅蛋白的提取與分離注意事項1.紅細胞的洗滌：

洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。2.凝膠的預(yù)處理：沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡3.色譜柱的裝填：

裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。4.色譜柱成功標志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實驗結(jié)果分析與評價

1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？三、實驗結(jié)果分析與評價2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。