53血紅蛋白的提取和分離課件

課題3血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)

－－蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、對(duì)其他分子的親和力等千差萬別。分離方法凝膠色譜法

凝膠電泳法

一、基礎(chǔ)知識(shí):一、基礎(chǔ)知識(shí)：（一）

凝膠色譜法（分配色譜法）：1、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖）

2、概念：根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的方法3、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)（）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（），移動(dòng)速度（），而（）的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（）移動(dòng)，路程（），移動(dòng)速度（），相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。相對(duì)分子質(zhì)量較小較長較慢相對(duì)分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快大分子通過凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；小分子穿過凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動(dòng)慢。4、分離過程

混合物上柱洗脫大分子流動(dòng)快小分子流動(dòng)慢收集大分子收集小分子

洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。

由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等緩沖溶液－－洗脫劑組成：配制：作用：調(diào)節(jié)緩沖劑的比例，配制不同pH的緩沖液。抵制外界酸堿對(duì)溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。（二）、緩沖溶液2．凝膠電泳法：（1）原理：待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。

(三)電泳1.電泳的概念指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程.在凝膠中加入SDS，形成“蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物”，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間的電荷差別，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。（2）分離方法：（3）分離過程：

瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。電泳檢測(cè)結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳樣品處理粗分離純化純度鑒定

血液組成成分

1.洗滌紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白二、實(shí)驗(yàn)操作血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細(xì)胞中________細(xì)胞數(shù)量最多，紅細(xì)胞的含量最高的有機(jī)化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構(gòu)成的，其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與O2和CO2結(jié)合的___________基團(tuán)。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素返回1.洗滌紅細(xì)胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌過程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色去除雜蛋白采集得到豬血初次離心后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果返回2.釋放血紅蛋白①蒸餾水的作用是________________________。②加入甲苯的作用是______________________。③充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀_____________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。磁力攪拌器返回3.分離血紅蛋白分離過程紅細(xì)胞混合液高速離心10min離心管濾紙過濾脂溶物質(zhì)燒杯分離血紅蛋白溶液有機(jī)溶劑（無色透明的甲苯層）脂類物質(zhì)（白色脂溶性物質(zhì)沉淀層）血紅蛋白溶液（紅色透明液體）紅細(xì)胞破碎物沉淀（暗紅色沉淀物）4.透析血紅蛋白20mmol/L磷酸緩沖液1mL1mL利用透析袋透析透析過程返回純化－－凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：3.樣品的加入和洗脫（二）凝膠色譜操作

（1）凝膠色譜柱的制作材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液裝填:2.凝膠色譜柱的裝填：步驟操作要求①②③④⑤立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴

凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計(jì)算稱量凝膠固定色譜柱（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。②凝膠的前處理：配制凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。

2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、洗脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。裝配好的凝膠柱3.樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。3.樣品的加入和洗脫3.樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。收集得到的純化后的血紅蛋白課題3血紅蛋白的提取與分離注意事項(xiàng)1.紅細(xì)胞的洗滌：

洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時(shí)離心。2.凝膠的預(yù)處理：沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡3.色譜柱的裝填：

裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。4.色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。