蛋白-蛋白互作研究方法-于凱

蛋白-蛋白互作研究酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)主要用于考察兩種蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生物轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4等都含有二個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，即AD和BD。這些轉(zhuǎn)錄因子只有同時(shí)具有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域時(shí)才能起始轉(zhuǎn)錄。由此，設(shè)計(jì)不同的兩個(gè)載體，一個(gè)含有AD基因（假設(shè)為A載體），另一個(gè)含有BD基因（假設(shè)為B載體）。一般將一個(gè)已知蛋白的基因連在B載體上，作為誘餌(Bait)，將未知蛋白的基因連在A載體上，將這兩個(gè)載體都轉(zhuǎn)到特定的酵母細(xì)胞內(nèi)，看未知蛋白與已知蛋白是否有相互作用。如果兩者有相互作用，那么就可以啟動報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，從而使這個(gè)酵母細(xì)胞能在選擇培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出來或者生存下來；如果兩者無相互作用，那么報(bào)告基因就無法表達(dá)，那么這個(gè)酵母細(xì)胞就無法在擇培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出來或者生存下來，如下圖所示：泛素酵母雙雜交系統(tǒng)由于酵母雙雜交系統(tǒng)不能鑒定膜蛋白間的相互作用，因此又發(fā)展出了分離泛素酵母雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)的原理如下圖所示：將泛素蛋白拆分為兩個(gè)片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一個(gè)LexA-VP16轉(zhuǎn)錄因子，此時(shí)它并不能激活基因轉(zhuǎn)錄（因?yàn)樗幌拗圃诹薈端段上，不能進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用）。將該C端段連到一個(gè)膜蛋白上，將N端段連接到另一個(gè)膜蛋白上。若兩個(gè)膜蛋白有相互作用，那么兩個(gè)膜蛋白在相互靠近時(shí)會使泛素蛋白的N端段和C端段靠近結(jié)合，形成一個(gè)完整的泛素蛋白。此時(shí)泛素蛋白酶體會將這一段被泛素標(biāo)記的片段降解，那么連接C端段的LexA-VP16轉(zhuǎn)錄因子掉落，即可進(jìn)入細(xì)胞核啟動標(biāo)記基因的表達(dá)。酵母三雜交系統(tǒng)

酵母三雜交的原理與雙雜交一樣，只是它研究的是兩個(gè)蛋白和第三個(gè)成分間的相互作用，通過第三個(gè)成分使兩個(gè)蛋白相互靠近。第三個(gè)成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下圖所示：

如上圖所示，在加入第三種成分前，蛋白X與蛋白Y之間并無直接相互作用，因此無法使BD和AD靠近，報(bào)告基因不能表達(dá)；當(dāng)加入第三種成分