CNPY2調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-eIF2α通路在有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)非酒精性脂肪性肝病中的作用

CNPY2調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2α通路在有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)非酒精性脂肪性肝病中的作用

李軍漢王佳倩李亞龍蔣昌君成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院（成都610041）非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD）是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)[1]。大多數(shù)NAFLD患者有單純性脂肪肝（肝臟輕度脂肪性變），少數(shù)患者發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎，并可逐步發(fā)展為肝硬化和肝癌[2]。在過(guò)去的幾十年里，NAFLD是全球最常見(jiàn)的慢性肝病之一，也被認(rèn)為是肝酶異常的最常見(jiàn)原因[3]。隨著肥胖和糖尿病的日益流行，NAFLD的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)逐漸上升[4]。目前，NAFLD的治療方法主要包括服用減肥藥物、實(shí)施減肥手術(shù)以及采用胰島素增敏劑、降脂劑、抗氧化劑、益生菌、抗腫瘤壞死因子藥、細(xì)胞保護(hù)劑和其他新藥等[5]。NAFLD在臨床治療上尚無(wú)特效藥[5]。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，NAFLD的發(fā)生與久坐少動(dòng)呈正相關(guān)。近期文獻(xiàn)[7]報(bào)道，飲食調(diào)整和運(yùn)動(dòng)等包含在內(nèi)的生活方式改變?yōu)橹委烴AFLD的首選方法。研究發(fā)現(xiàn)[8]，運(yùn)動(dòng)可有效改善NAFLD。但迄今為止，運(yùn)動(dòng)改善NAFLD的分子作用機(jī)制不詳。Canopy成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)調(diào)節(jié)因子2（CanopyFGFsignalingregulator2，CNPY2）是一種含有皂苷B-型域的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblastgrowthfactor21，F(xiàn)GF21）調(diào)節(jié)蛋白。Hatta等[9]首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，檢測(cè)了CNPY2蛋白和CNPY2mRNA在小鼠體內(nèi)的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNPY2在骨骼肌、心肌、平滑肌、血液、內(nèi)皮和上皮等不同器官和組織中廣泛分布，以心臟、肺、胰腺和肝臟中表達(dá)較高，在骨骼肌、腎臟、脾臟和胃中表達(dá)次之，在睪丸、大腦、大腸和小腸中表達(dá)最少；其次，在唾液腺、乳腺和甲狀腺管腔中，CNPY2染色顯陽(yáng)性，提示CNPY2作為內(nèi)分泌蛋白發(fā)揮細(xì)胞外泌體作用的可能性。目前，CNPY2沒(méi)有得到廣泛的研究，其已知的生物學(xué)功能十分有限。有限的文獻(xiàn)研究報(bào)道，CNPY2參與神經(jīng)突生長(zhǎng)、膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移過(guò)程[10]。在缺氧時(shí)，低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxiainduciblefactor1，HIF-1α）可引起血管平滑肌細(xì)胞CNPY2表達(dá)增加[11]。CNPY2通過(guò)FGF21調(diào)節(jié)低密度脂蛋白受體和細(xì)胞脂蛋白代謝[12]。此外，在人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌（non-smallcelllungcancer，NSCLC）中，CNPY2通過(guò)激活核因子-κB（nuclearfactor-κB，NF-κB）抑制NSCLC細(xì)胞凋亡[13]。由此可見(jiàn)，CNPY2在細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、凋亡和脂質(zhì)代謝中扮演重要作用[14]。近期文獻(xiàn)[15]報(bào)道，CNPY2在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)。有學(xué)者[16]通過(guò)10周高脂膳食喂養(yǎng)成功誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNPY2調(diào)控PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)狀激酶（proteinkinaseR-likeERki?nase，PERK）/真核細(xì)胞翻譯起始因子2α（eukaryotictranslationinitiationfactor2α，eIF2α）信號(hào)通路在NAFLD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。運(yùn)動(dòng)作為一種低成本治療手段，可有效預(yù)防和改善NAFLD，其深層機(jī)制被證實(shí)與運(yùn)動(dòng)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmicreticulumstress，ERS）水平相關(guān)[17]。然而，運(yùn)動(dòng)是否通過(guò)CNPY2調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2a通路，從而發(fā)揮其對(duì)NAFLD的改善作用，尚不得而知。有關(guān)運(yùn)動(dòng)改善非酒精性脂肪性肝病的研究多為人體[18]和動(dòng)物[19]實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。研究表明，體內(nèi)能量代謝關(guān)鍵蛋白激酶—腺苷磷酸活化蛋白激酶（adenosinemonophosphate-activatedproteinki?nase，AMPK）在不同運(yùn)動(dòng)時(shí)均可被激活，因此，AMPK激動(dòng)劑在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中常用來(lái)模擬運(yùn)動(dòng)刺激[20，21]。本研究聚焦于CNPY2調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2a信號(hào)通路，通過(guò)高脂膳食誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型，并進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)；同時(shí)，通過(guò)棕櫚酸（palmiticacid，PA）誘導(dǎo)構(gòu)建HepG2細(xì)胞NAFLD體外模型[22]，采用AMPK激動(dòng)劑（GSK621）、CNPY2重組蛋白和PERK抑制劑（GSK2606414）干預(yù)，探討CNPY2調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2α信號(hào)通路在有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)NAFLD中的可能作用機(jī)制，以期為NAFLD的運(yùn)動(dòng)康復(fù)和相關(guān)靶點(diǎn)篩選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。1材料與方法1.1主要儀器與試劑主要儀器：LEICARM2126切片機(jī)、YT-6C生物組織攤烤片機(jī)、勻漿機(jī)、蛋白定量?jī)x、Bio-Rad水平電泳儀和轉(zhuǎn)移槽、凝膠成像系統(tǒng)、BMII型病理組織包埋機(jī)、OlympusBX51光學(xué)顯微鏡、NikonEclipse55i熒光顯微鏡等。主要試劑：人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；棕櫚酸（P5585）和油紅O（01391）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗體CNPY2（14635-1-AP）和PERK（20582-1-AP）購(gòu)自proteintech公司；抗體血紅素加氧酶-1（haemoxygenase-1，HO-1）（ET1604-45），NADPH氧化酶-1（NADPHoxidase1，NOX-1）（ER1913-99）和p-eIF2α（ET1603-14）購(gòu)自華安生物；抗體核因子E2相關(guān)因子2（nuclearfactorE2-relatedfactor2，Nrf2）（ab92946）、IgG（ab6721）購(gòu)自abcam公司；β-actin（AC026）購(gòu)自abclonal公司；ELISA檢測(cè)試劑盒白介素-1a（interleukin-1α，IL-1α）（ZC-32340）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）（ZC-32446）和腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）（ZC-35733）購(gòu)自上海茁彩。CNPY2重組蛋白（13771-H08H）購(gòu)自SinoBilogical公司；AMPK激動(dòng)劑（GSK621）（516535-5MC）購(gòu)自MCE公司；PERK抑制劑（GSK2606414）（B6020-1mg）購(gòu)自APEBIO公司。1.2動(dòng)物分組及模型評(píng)價(jià)1.2.1動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)方案30只8周齡雄性C57/BL6J小鼠由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供，SPF/VAF級(jí)，許可證編號(hào)：JSNJ（蘇）2020-0003，按隨機(jī)數(shù)字表法分為普通飲食組（普飲組）、高脂飲食組（高脂組）和高脂飲食運(yùn)動(dòng)組（高脂運(yùn)動(dòng)組），每組10只。所有小鼠在成都體育學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心小動(dòng)物房?jī)?nèi)分籠飼養(yǎng)，室溫18℃～22℃，相對(duì)濕度45%～55%，12h陰暗交替，自由飲食飲水。普飲組給予普通飼料飼養(yǎng)，高脂組和高脂運(yùn)動(dòng)組給予高脂飼料飼養(yǎng)，連續(xù)飼養(yǎng)18周。在實(shí)驗(yàn)第9周，從各組中分別隨機(jī)抽取2只小鼠，禁食12h，以4ml/kg腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉，取肝臟左葉做油紅O病理形態(tài)檢測(cè)，結(jié)合血脂變化，以確認(rèn)模型制備成功[23]。從第10周開(kāi)始，高脂運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取小鼠肝臟。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案[24]：高脂運(yùn)動(dòng)組小鼠先進(jìn)行1周跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練，初始速度為8m/min×10min，20min/d，每天以0.5m/min的速度和10min/d的時(shí)間遞增，直至運(yùn)動(dòng)時(shí)間達(dá)到60min/d，運(yùn)動(dòng)速度達(dá)到12m/min，正式運(yùn)動(dòng)持續(xù)8周，每周運(yùn)動(dòng)5天，普飲組和高脂組小鼠靜置于沒(méi)有開(kāi)機(jī)的跑步機(jī)上，持續(xù)時(shí)間和頻率與高脂運(yùn)動(dòng)組相同。1.2.2取材和模型評(píng)價(jià)為避免運(yùn)動(dòng)應(yīng)激反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后48h取材。取材前禁食12h，以4ml/kg腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉，以腹部正中切口打開(kāi)腹腔，迅速取出肝臟。用4%多聚甲醛將肝組織固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。采用NAS評(píng)分[25]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肝組織脂肪性變進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。NAS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：含脂肪滴肝細(xì)胞散在、稀少，0分；含脂肪滴肝細(xì)胞≤1/4，1分；含脂肪滴肝細(xì)胞≤1/2，2分；含脂肪滴肝細(xì)胞≤3/4，3分；肝組織幾乎被脂滴所代替，其面積>3/4，4分。1.3HepG2細(xì)胞培養(yǎng)與分組HepG2細(xì)胞用含10%FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并放置在條件為37℃、5%CO2和95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，至細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%時(shí)加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1：3比例進(jìn)行傳代及后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)驗(yàn)分為8組：即空白對(duì)照組（C組），模型組（M組），AMPK激動(dòng)劑干預(yù)組（GSK621組），CNPY2重組蛋白干預(yù)組（CNPY2組），CNPY2重組蛋白+AMPK激動(dòng)劑干預(yù)組（CNPY2+GSK621組），CNPY2重組蛋白+PERK抑制劑干預(yù)組（CNPY2+GSK2606414組），AMPK激動(dòng)劑+PERK抑制劑干預(yù)組（GSK621+GSK2606414組），CNPY2重組蛋白+AMPK激動(dòng)劑+PERK抑制劑干預(yù)組（CNPY2+GSK621+GSK2606414組）。除空白對(duì)照組外，其余各組在加入棕櫚酸（palmit?icacid，PA）（濃度250μM）孵育肝細(xì)胞24h，誘導(dǎo)NAFLD體外模型后[22]，采用AMPK激動(dòng)劑（GSK621）（濃度1μM）模擬細(xì)胞水平運(yùn)動(dòng)效應(yīng)[21]，以及CNPY2重組蛋白（CNPY2）（濃度2.5ng/mL）和PERK抑制劑（GSK2606414）（濃度0.5μM）干預(yù)24h。具體干預(yù)方案為：GSK621組加入AMPK激動(dòng)劑干預(yù)24h；CNPY2組加入CNPY2重組蛋白干預(yù)24h；CNPY2+GSK621組加入AMPK激動(dòng)劑和CNPY2重組蛋白共同干預(yù)24h；CNPY2+GSK2606414組加入CNPY2重組蛋白和PERK抑制劑共同干預(yù)24h；GSK621+GSK2606414組加入AMPK激動(dòng)劑和PERK抑制劑共同干預(yù)24h；CNPY2+GSK621+GSK2606414加入AMPK激動(dòng)劑、CNPY2重組蛋白和PERK抑制劑共同干預(yù)24h。1.4蛋白提取和WesternBlotting檢測(cè)提取肝組織和肝細(xì)胞總蛋白，具體步驟如下：肌組織50mg，加人預(yù)冷RIPA裂解液500μ1，電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，靜置10min后，12000rpm低溫離心15min，取上清；收集肝細(xì)胞蛋白，超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞后靜置10min，4℃離心，取上清，BCA法測(cè)肝組織和肝細(xì)胞總蛋白含量。SDS凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，室溫下5%BSA封閉1h，4℃過(guò)夜孵育一抗，CNPY2稀釋濃度為1∶400，PERK、HO-1、Nrf2、NOX-1、p-eIF2α稀釋濃度均為1∶1000，β-actin稀釋濃度為1∶100000。次日TBST清洗，室溫孵育二抗1h，再次TBST清洗。ECL發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像。βactin作為內(nèi)參，使用Gel-pro圖像分析軟件，對(duì)WesternBlot結(jié)果進(jìn)行灰度掃描并量化分析，蛋白表達(dá)量用“目的蛋白/β-actin”計(jì)算。1.5HepG2細(xì)胞油紅O染色用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞3次，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10min。加入油紅O染液于6孔板內(nèi)，室溫反應(yīng)10min，用60%的異丙醇進(jìn)行脫色，緊接著用蘇木素染核30s，重新用60%的異丙醇清洗2～3次，倒置顯微鏡下觀察，油紅O染色結(jié)果進(jìn)行量化分析。同時(shí)將細(xì)胞種植于96孔板，重復(fù)上述操作，最后使用100%異丙醇溶解已染色的細(xì)胞，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)600nm處檢測(cè)其吸光度值。1.6HepG2細(xì)胞qRT-PCR檢測(cè)按照Trizol法提取HepG2細(xì)胞總RNA，用Nano?dropND-1000分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度及濃度，選取OD值在1.80～2.0間的樣品按照TAKARAPrimeScriptTMRTMasterMix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄體系為20μL。RT-PCR反應(yīng)體系為10μL，按照TAKARASYBRPremixExTaqTMⅡ（TliR?NaseHPlus）試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用LightCycler480進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。所有引物設(shè)計(jì)與合成委托由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，并以ULTRAPAGE純化，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。以β-actin作為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算相對(duì)量，采用2－ΔΔCT法分析。表1引物設(shè)計(jì)1.7HepG2細(xì)胞上清液ELISA檢測(cè)將各組細(xì)胞培養(yǎng)基移取至離心管中，在4℃下以1500rpm的速度離心10min，收集各組細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)各組上清液中IL-6、IL-1α、TNF-α細(xì)胞因子水平。每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法2結(jié)果2.1小鼠肝組織病理形態(tài)變化各組小鼠肝臟病理形態(tài)結(jié)果（圖1A）顯示：高脂組肝細(xì)胞可見(jiàn)明顯脂肪性變，肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂肪空泡充填；高脂運(yùn)動(dòng)組肝細(xì)胞脂肪性變程度顯著減輕。肝細(xì)胞脂肪性變積分結(jié)果（圖1B）顯示：高脂組肝細(xì)胞脂肪性變積分較普飲組顯著升高（P＜0.05），高脂運(yùn)動(dòng)組肝細(xì)胞脂肪性變積分較高脂組顯著降低（P＜0.05），提示有氧運(yùn)動(dòng)顯著改善小鼠肝組織病理形態(tài)。圖1各組肝臟病理形態(tài)變化（×400）2.2各組小鼠肝組織CNPY2介導(dǎo)PERK/eIF2α信號(hào)通路表達(dá)變化各組小鼠肝組織WesternBlotting結(jié)果（見(jiàn)圖2）顯示，與普飲組比較，高脂組CNPY2、PERK、p-eIF2α蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與高脂組比較，高脂運(yùn)動(dòng)組以上指標(biāo)顯著降低（P＜0.05），提示有氧運(yùn)動(dòng)下調(diào)小鼠肝組織CNPY2表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2α信號(hào)通路。圖2各組小鼠肝組織CNPY2介導(dǎo)PERK/eIF2α信號(hào)通路表達(dá)變化2.3各組HepG2細(xì)胞油紅O染色變化各組HepG2細(xì)胞油紅O染色結(jié)果（見(jiàn)圖3A）顯示，對(duì)照組肝細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞排列整齊，肝細(xì)胞呈不規(guī)則多角形或卵圓形生長(zhǎng)，胞質(zhì)染色淺淡或無(wú)明顯著色；與對(duì)照組比較，模型組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多；與模型組比較，CNPY2重組蛋白干預(yù)組紅染顆粒增加，其余干預(yù)組脂滴數(shù)量較模型組不同程度減少。各組肝細(xì)胞脂滴光密度結(jié)果（見(jiàn)圖3B）顯示：模型組（M組）肝細(xì)胞脂滴光密度較對(duì)照組（C組）顯著增加（P＜0.01）；與模型組（M組）比較，CNPY2重組蛋白干預(yù)組（CNPY2組）肝細(xì)胞脂滴光密度顯著增加（P＜0.05），AMPK激動(dòng)劑干預(yù)組（GSK621組）肝細(xì)胞脂滴光密度顯著下降（P＜0.05）；與CNPY2組比較，CNPY2+GSK2606414組和CNPY2+GSK621組肝細(xì)胞脂滴光密度均顯著下降（P＜0.05）；與GSK621+GSK2606414組比較，GSK621+GSK2606414+CNPY2組肝細(xì)胞脂滴光密度顯著升高（P＜0.05）。圖3各組HepG2細(xì)胞脂滴變化（×400）2.4各組HepG2細(xì)胞CNPY2介導(dǎo)PERK/eIF2α信號(hào)通路表達(dá)變化各組HepG2細(xì)胞CNPY2介導(dǎo)PERK/eIF2α信號(hào)通路表達(dá)變化結(jié)果（見(jiàn)圖4）顯示：與對(duì)照組（C組）比較，模型組（M組）肝細(xì)胞CNPY2、PERK和p-eIF2α、CNPY2mRNA和PERKmRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與M組比較，CNPY2重組蛋白干預(yù)組（CNPY2）以上分子表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），AMPK激動(dòng)劑干預(yù)組（GSK621）以上分子表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與CNPY2組比較，CNPY2+GSK621組和CNPY2+GSK2606414組以上分子表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；與GSK2606414+GSK621組比較，GSK2606414+GSK621+CNPY2組以上分子表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。圖4各組HepG2細(xì)胞CNPY2介導(dǎo)PERK/eIF2α信號(hào)通路表達(dá)變化2.5各組HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激分子表達(dá)變化各組HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激分子表達(dá)變化結(jié)果（見(jiàn)圖5）顯示：與對(duì)照組（C組）比較，模型組（M組）肝細(xì)胞Nrf2、HO-1、NOX-1蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與M組比較，CNPY2重組蛋白干預(yù)組（CNPY2）以上分子表達(dá)顯著升高（P＜0.05），AMPK激動(dòng)劑干預(yù)組（GSK621）以上分子表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與CNPY2組比較，CNPY2+GSK621組和CNPY2+GSK2606414組以上分子表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；與GSK2606414+GSK621組比較，GSK2606414+GSK621+CNPY2組以上分子表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。圖5各組HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激分子表達(dá)變化2.6各組HepG2細(xì)胞炎癥因子濃度變化各組HepG2細(xì)胞炎癥因子濃度變化結(jié)果（見(jiàn)圖6）顯示：與對(duì)照組（C組）比較，模型組（M組）肝細(xì)胞上清液IL-1a、IL-6和TNF-a濃度顯著增加（P＜0.05）；與M組比較，CNPY2重組蛋白干預(yù)組（CNPY2）以上分子濃度顯著升高（P＜0.05），AMPK激動(dòng)劑干預(yù)組（GSK621）以上分子濃度顯著降低（P＜0.05）；與CNPY2組比較，CNPY2+GSK621組和CNPY2+GSK2606414組以上分子濃度顯著降低（P＜0.05）；與GSK2606414+GSK621組比較，GSK2606414+GSK621+CNPY2組以上分子濃度顯著升高（P＜0.05）。圖6各組HepG2細(xì)胞炎癥因子濃度變化3討論與分析NAFLD是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)，其主要病理學(xué)特征為肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，早期病理僅為單純性肝細(xì)胞脂肪樣變，而中晚期會(huì)繼發(fā)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞凋亡和壞死[26]。動(dòng)物模型和細(xì)胞模型是NAFLD研究的常用手段。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、能模擬體內(nèi)環(huán)境，但個(gè)體差異較大[27]；細(xì)胞模型簡(jiǎn)便、高效，能克服個(gè)體差異的影響，更適于開(kāi)展機(jī)制研究[28]。病理形態(tài)組織學(xué)是NAFLD診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[29]。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD小鼠動(dòng)物模型，肝組織病理形態(tài)結(jié)果顯示，高脂組肝細(xì)胞脂肪性變較普飲組顯著增加，提示NAFLD動(dòng)物模型復(fù)制成功。NAFLD體外模型的構(gòu)建常采用棕櫚酸誘導(dǎo)、油酸誘導(dǎo)、游離脂肪酸誘導(dǎo)、油酸與棕櫚酸按一定比例混合誘導(dǎo)等方法[30]。棕櫚酸（PA）容易引發(fā)肝臟的脂肪變性，是飲食和血清中最豐富的游離脂肪酸[31]。PA常用于誘導(dǎo)肝細(xì)胞HepG2體外模擬非酒精性脂肪肝的損傷及脂質(zhì)沉積[32].。研究報(bào)道[22]，棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24h，肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累顯著增多，提示棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24h可成功建立NAFLD體外模型。本研究結(jié)果顯示：模型組在棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24h后，油紅O染色可見(jiàn)其肝細(xì)胞內(nèi)脂滴顯著增加，提示本研究成功誘導(dǎo)肝細(xì)胞NAFLD體外模型。研究報(bào)道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是NAFLD發(fā)展進(jìn)程中重要的病理基礎(chǔ)[33]。ERS的信號(hào)通路由PERK、ATF6和IRE1α三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78（BiP）組成。在非應(yīng)激狀態(tài)下，BiP的腔域抑制著PERK、ATF6和IRE1α的活性，并與這些跨膜蛋白結(jié)合。然而，當(dāng)未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累時(shí)，BiP與PERK、IRE1α和ATF6α解離，優(yōu)先與未折疊蛋白結(jié)合，從而激活ERS信號(hào)通路[34]。CNPY2是CNPY蛋白家族（CNPY1、CNPY2、CNPY3和CNPY4）之一，它是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可溶性蛋白[15]。有研究[16]報(bào)道，CNPY2參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，CNPY2可激活PERK/eIF2α通路，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要分子組成之一。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CNPY2介導(dǎo)PERK/eIF2α通路參與高脂膳食誘導(dǎo)小鼠NAFLD形成，有氧運(yùn)動(dòng)可有效抑制CNPY2/PERKeIF2α通路活性，降低CNPY2/PERK-eIF2α通路相關(guān)分子表達(dá)，從而有效改善NAFLD。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，棕櫚酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞NAFLD體外模型，與對(duì)照組比較，模型組CNPY2/PERK-eIF2α通路相關(guān)分子表達(dá)顯著升高。與模型組比較，CNPY2重組蛋白干預(yù)組上述通路相關(guān)分子表達(dá)顯著升高，AMPK激動(dòng)劑干預(yù)組上述通路相關(guān)分子表達(dá)顯著降低，提示CNPY2重組蛋白干預(yù)可激活CNPY2/PERK-eIF2α信號(hào)通路，促進(jìn)棕櫚酸作用效應(yīng)，而AMPK激動(dòng)劑有效抑制CNPY2/PERKeIF2α信號(hào)通路，逆轉(zhuǎn)棕櫚酸作用效應(yīng)。研究結(jié)果還顯示，AMPK激動(dòng)劑和PERK抑制劑均可逆轉(zhuǎn)CNPY2重組蛋白干預(yù)效應(yīng)，提示AMPK激動(dòng)劑（模擬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)效應(yīng)）通過(guò)CNPY2有效抑制PERK/eIF2α信號(hào)通路活性，從而逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞NAFLD。以上研究結(jié)果共同表明，CNPY2介導(dǎo)PERK/eIF2α信號(hào)通路在有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)NAFLD中發(fā)揮重要作用。有氧運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)下調(diào)CNPY2表達(dá)，抑制PERK/eIF2α信號(hào)通路活性，降低PERK/eIF2α信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)，從而改善NAFLD。研究報(bào)道，NAFLD中肝細(xì)胞ERS與肝細(xì)胞脂質(zhì)異常積聚、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[3